免疫共沉淀蛋白复合体分离

检测项目

诱饵蛋白验证：在实验开始前，需通过Western Blot等方法确认细胞或组织中目标诱饵蛋白的表达情况。

抗体特异性评估：验证用于沉淀的抗体是否能够特异性地识别并结合目标蛋白，而不产生非特异性吸附。

蛋白复合体结合验证：核心检测项目，旨在证实诱饵蛋白与推测的相互作用蛋白在体内确实存在物理结合。

相互作用强度分析：通过调整洗脱条件或进行定量分析，半定量地评估蛋白质相互作用的强弱。

内源性相互作用检测：在不进行过表达的情况下，研究内源蛋白在自然表达水平下的相互作用。

外源性相互作用检测：通过转染使诱饵蛋白过表达，研究其与潜在互作蛋白的结合。

翻译后修饰依赖的互作：检测蛋白质的磷酸化、泛素化等修饰状态是否为其互作所必需。

竞争性结合实验：通过加入竞争性多肽或突变体，验证相互作用的特异性位点。

动态相互作用监测：在不同时间点或不同处理条件下取样，研究蛋白质相互作用的动态变化。

复合体组分筛选：作为质谱分析的前置步骤，用于从复杂样品中富集特定的蛋白复合体。

检测范围

信号通路蛋白复合物：应用于研究MAPK、PI3K/Akt等信号转导通路中上下游蛋白的瞬时相互作用。

转录调控复合体：用于分离转录因子、共激活子、共抑制子以及染色质修饰酶等组成的调控复合物。

细胞骨架相关复合体：检测肌动蛋白、微管等细胞骨架蛋白及其结合蛋白的动态组装。

膜受体与适配蛋白：研究细胞膜表面受体与其下游信号适配蛋白之间的相互作用。

酶与底物/抑制剂：用于验证激酶与底物、蛋白酶与其抑制剂等酶学相关的直接结合。

病毒/病原体与宿主蛋白：揭示病毒蛋白如何劫持或干扰宿主细胞的蛋白互作网络。

DNA损伤修复复合体：分离和研究参与DNA损伤应答的多种蛋白质机器。

泛素化/SUMO化连接酶系统：用于鉴定E3连接酶与其特异性底物之间的相互作用。

核糖体与翻译因子：研究蛋白质翻译过程中核糖体与各类起始、延伸、终止因子的结合。

药物靶点验证：在药物研发中，用于验证小分子药物是否影响特定蛋白质复合体的形成或解离。

检测方法

细胞裂解液制备：使用温和的非变性裂解液（如NP-40裂解液）破碎细胞，保持天然蛋白相互作用的完整性。

抗体-琼脂糖珠预处理：将特异性抗体共价或非共价偶联到Protein A/G琼脂糖珠上，制备免疫吸附介质。

预清除：用无关抗体或裸珠预处理裂解液，去除能非特异性结合到珠子或抗体上的杂蛋白。

免疫沉淀反应：将预处理后的裂解液与抗体-珠子在4°C下缓慢旋转孵育数小时至过夜，使抗原-抗体-珠子复合物形成。

严格洗涤：使用含有适当浓度盐和去垢剂的洗涤缓冲液多次清洗珠子，彻底去除非特异性结合的污染物。

<强>SDS-PAGE上样样品制备：向沉淀得到的珠子中加入SDS上样缓冲液，煮沸使蛋白变性并从珠子上解离。

<强>SDS-PAGE电泳分离：将洗脱的样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据分子量大小分离蛋白质组分。

<强>Western Blot鉴定：将凝胶上的蛋白转印至膜上，用针对互作蛋白的抗体进行探测，验证其是否存在。

<强>质谱鉴定分析：将凝胶上的特异条带或整个泳道胶块切下，进行酶解和质谱分析，以发现新的互作蛋白。

<强>对照实验设计：必须设置同型IgG对照、空载体对照或不相关抗体对照，以排除假阳性结果。

检测仪器设备

<强>低温高速离心机：用于细胞收集、裂解液澄清以及免疫沉淀过程中的所有离心步骤，需具备4°C控温能力。

<强>垂直板电泳系统：用于运行SDS-PAGE凝胶，分离免疫沉淀得到的复杂蛋白质样品。

<强>半干/湿式转印系统：将SDS-PAGE凝胶上分离的蛋白质高效、均匀地转印至PVDF或NC膜上。

<强>化学发光成像系统：用于检测Western Blot后膜上的化学发光信号，对互作蛋白进行成像和定量分析。

<强>旋转混合仪：确保免疫沉淀孵育过程中样品与珠子充分、温和地接触混合，通常需在冷室中使用。

<强>超声波细胞破碎仪（可选）：对于某些难以裂解的组织或细菌样本，可用于辅助破碎。

<强>酶标仪（可选）：用于BCA法等定量测定裂解液中的总蛋白浓度，确保上样量一致。

<强>质谱仪（如LC-MS/MS）：用于对Co-IP富集的蛋白复合体进行高通量鉴定和测序的核心高端设备。

<强>-80°C超低温冰箱：用于长期保存组织样本、细胞沉淀、裂解液以及制备好的抗体偶联珠子。

<强>精密电子天平与pH计：用于精确配制各种缓冲液、裂解液和电泳试剂，保证实验体系稳定。

检测流程

线上咨询或者拨打咨询电话;

获取样品信息和检测项目;

支付检测费用并签署委托书;

开展实验，获取相关数据资料;

出具检测报告。