单抗二硫键配对质谱验证

检测项目

完整分子量测定：通过高分辨质谱测定完整单抗或其亚单位的分子量，初步判断二硫键是否全部形成，是否存在游离巯基。

肽图分析与覆盖率确认：通过酶切产生肽段，经质谱检测获得高序列覆盖率，是定位二硫键的基础。

二硫键连接肽段鉴定：特异性识别并鉴定出由二硫键连接的两个或多个肽段形成的复合离子。

二硫键配对准确性验证：确认轻链与重链间（Inter-chain）以及重链内（Intra-chain）二硫键是否按照理论模式正确配对。

游离巯基定量分析：使用烷基化试剂标记游离巯基，通过质谱定量分析未正确形成二硫键的巯基比例。

二硫键异构体检测：检测因二硫键错配（Scrambling）而产生的非天然异构体，评估产品异质性。

强制降解研究中的二硫键稳定性：在热、光、氧化等应激条件下，监测二硫键的断裂、重排或新键形成。

糖型对二硫键区域影响的评估：分析不同糖基化修饰是否影响附近二硫键的稳定性或可及性。

药物-抗体偶联物（ADC）的二硫键分析：对于通过半胱氨酸残基偶联的ADC，需验证偶联过程对原有二硫键的影响及新连接键的性质。

批间一致性比较：对比不同生产批次单抗样品的二硫键配对图谱，确保生产工艺的稳定性和产品质量的一致性。

检测范围

IgG1, IgG2, IgG4等亚型：覆盖不同IgG亚型，其铰链区二硫键数量与连接模式存在差异，需针对性分析。

抗体轻链与重链：涵盖轻链（LC）内一个二硫键，重链（HC）内四个二硫键（以IgG1为例）的验证。

铰链区二硫键：重点分析连接两条重链的铰链区二硫键，其对于抗体结构完整性和功能至关重要。

Fab与Fc区域：分别验证抗原结合片段（Fab）和可结晶片段（Fc）内的所有二硫键。

工程化或突变抗体：针对引入或移除半胱氨酸残基的工程化抗体，验证其设计二硫键是否正确形成。

双特异性抗体：分析其非天然结构设计中可能存在的复杂二硫键连接模式。

抗体片段（如scFv, Fab, F(ab')2）：验证这些较小片段中保留的二硫键的正确性。

不同表达系统产物：涵盖CHO、HEK293等哺乳动物细胞表达系统生产的单抗，比较可能存在的细微差异。

工艺中间体与原液/成品：从上游纯化中间体到最终制剂成品，全程监控二硫键状态。

强制降解样品与稳定性样品：评估在加速稳定性试验和长期稳定性研究中二硫键的变化情况。

检测方法

非还原肽图分析（NRP）：核心方法。样品不经还原剂处理直接酶切，质谱直接鉴定由二硫键连接的肽段对。

还原与非还原对比分析：平行进行还原肽图（断开所有二硫键）和非还原肽图，通过肽段质量位移和出现/消失来指认二硫键。

部分还原与烷基化：使用温和还原剂部分打开二硫键，随后烷基化标记，通过质谱解析复杂的连接网络。

高分辨质谱（HRMS）与串联质谱（MS/MS）：使用高精度质量数确定连接肽段的组成，并通过碰撞诱导解离（CID）或电子转移解离（ETD）等获取序列信息确认连接位点。

自上而下（Top-Down）质谱：对完整蛋白或大片段直接进行碎裂，可在更高层次上获取二硫键连接信息，但解析复杂。

自中而下（Middle-Down）质谱：对有限酶切或化学切割产生的较大片段进行分析，平衡了自上而下和自下而上的优势。

离子淌度质谱（IMS-MS）：根据离子形状和大小进行分离，可区分二硫键连接异构体，提供互补的构象信息。

质谱数据依赖采集（DDA）与数据非依赖采集（DIA）：DDA针对性地采集母离子进行碎裂；DIA无差别采集所有离子信息，更适合复杂样品筛查。

二硫键特异性搜索算法：利用ProteinPilot、Mascot、Byonic等软件中的特定设置，在数据库搜索中专门鉴定二硫键连接肽段。

定量质谱方法（如MRM）：开发多反应监测方法，对特定二硫键连接肽段进行绝对或相对定量，用于快速批次放行或稳定性指示。

检测仪器设备

高分辨液相色谱-质谱联用仪（LC-HRMS）：核心设备，如Q-TOF、Orbitrap系列，提供高质量精度和分辨率，用于精确鉴定连接肽段。

三重四极杆质谱仪（LC-MS/MS）：用于靶向定量分析特定二硫键肽段或游离巯基标记物，灵敏度高，重现性好。

纳升液相色谱系统（nanoLC）：与高灵敏质谱联用，用于微量样品分析，提高低丰度二硫键肽段的检测能力。

超高效液相色谱系统（UHPLC）：提供快速、高分离度的色谱分离，在常规肽图分析中广泛应用。

离子淌度质谱仪（如LC-IMS-Q-TOF）：集成离子淌度分离单元，用于分离共洗脱的异构体并研究二硫键相关的构象差异。

蛋白质快速酶切与制备系统：自动化样品前处理工作站，实现从还原/烷基化到酶切过程的标准化和高效化。

高效酶切试剂（如Trypsin, Lys-C, Glu-C）：特异性蛋白酶，用于产生适合质谱分析且包含二硫键的肽段。

在线或离线还原/烷基化装置：用于在色谱分离前或柱后进行受控的化学处理，以辅助二硫键定位。

数据处理工作站与专业软件：配备高性能计算机和专业软件（如Biopharma Finder, Skyline, PEAKS），用于海量质谱数据的处理、解析和可视化。

完整的样品保存与处理低温设备：包括-80°C冰箱、低温离心机等，确保样品在制备过程中二硫键状态不发生变化。

检测流程

线上咨询或者拨打咨询电话;

获取样品信息和检测项目;

支付检测费用并签署委托书;

开展实验，获取相关数据资料;

出具检测报告。