转录组测序分析

检测项目

总RNA提取与质控：从细胞或组织中分离完整的总RNA，并通过电泳、分光光度计等方法评估其浓度、纯度与完整性，确保样本质量满足建库要求。

mRNA富集或rRNA去除：通过oligo(dT)磁珠法选择性富集真核生物mRNA，或使用探针杂交法去除原核/真核生物中高丰度的核糖体RNA，以获取目标转录本。

cDNA文库构建：将RNA片段逆转录为双链cDNA，并在其两端连接测序接头，构建成可用于高通量测序的文库，此过程包括片段化、末端修复、加A尾、连接接头等步骤。

文库质量评估与定量：使用Qubit、qPCR或生物分析仪等设备对构建好的cDNA文库进行精确定量和片段大小分布检测，确保文库质量合格且浓度均一。

高通量测序：将合格文库加载至测序芯片，在测序仪上进行桥式PCR扩增与边合成边测序，产生海量的原始序列读数。

原始数据质控：对测序仪下机产生的原始数据进行质量评估，包括碱基质量分布、GC含量、接头污染及重复序列比例等，并过滤低质量读长。

序列比对与定位：将高质量测序读长与参考基因组进行比对，确定每个读长在基因组上的精确位置，是后续定量和差异分析的基础。

基因/转录本表达定量：基于比对结果，统计比对到每个基因或转录本上的读长数目，计算其表达水平，常用指标有FPKM、TPM或Count值。

差异表达分析：通过统计学模型比较不同组别间基因的表达水平，识别在特定条件下表达量发生显著上调或下调的基因。

功能富集分析：对差异表达基因集合进行基因本体论、KEGG通路等数据库的注释与富集分析，揭示其参与的生物学过程、分子功能及信号通路。

检测范围

信使RNA：检测携带遗传信息并指导蛋白质合成的信使RNA，是转录组分析最核心的目标，用于揭示基因的表达活性。

长链非编码RNA：检测长度超过200个核苷酸且不编码蛋白质的RNA分子，研究其在染色质修饰、转录调控等过程中的功能。

微小RNA：检测长度约22个核苷酸的内源性非编码小RNA，分析其通过靶向mRNA参与转录后基因表达调控的作用。

环状RNA：检测由pre-mRNA反向剪接形成的共价闭合环状RNA分子，探索其作为miRNA海绵或参与翻译调控的功能。

可变剪接事件：检测同一基因通过不同剪接方式产生多种转录本异构体的现象，解析其在细胞分化、疾病发生中的意义。

基因融合事件：检测由于染色体易位、缺失等原因导致两个独立基因的编码序列连接在一起形成的新型融合转录本，常见于癌症研究。

新转录本发现：在无参考基因组或注释不全的物种中，通过从头组装识别新的基因位点、转录本异构体或非编码RNA。

单核苷酸变异：在转录本水平上检测由RNA编辑或基因组DNA变异导致的单碱基序列改变。

等位基因特异性表达：检测来自父本和母本的两个等位基因在二倍体细胞中表达水平的差异，反映表观遗传调控。

全转录组关联分析：将基因表达水平作为数量性状，与表型或疾病状态进行大规模关联分析，寻找与性状显著相关的表达数量性状位点。

检测方法

Poly(A)尾捕获法：利用oligo(dT)引物或磁珠与mRNA的3‘端Poly(A)尾特异性结合，从而富集真核生物mRNA的主流方法。

rRNA去除法：使用与rRNA序列互补的DNA或RNA探针通过杂交将其去除，适用于原核生物、降解样本或需保留非polyA RNA的研究。

链特异性建库：在建库过程中保留转录本来源链的信息，能准确区分正义与反义转录本，对于研究反义转录调控至关重要。

SMART技术：利用逆转录酶末端转移酶活性，在cDNA第一链合成时添加特定接头，尤其适用于低起始量RNA或单细胞全长转录组建库。

Illumina边合成边测序：当前最主流的二代测序技术，通过可逆终止子循环测序，产生高质量、高通量的短读长序列数据。

PacBio SMRT测序：基于单分子实时测序的三代长读长技术，无需PCR扩增，可直接读取长达数万碱基的完整转录本序列。

Oxford Nanopore测序：基于纳米孔电信号变化的三代测序技术，能产生超长读长，并支持直接RNA测序，无需逆转录步骤。

数字基因表达谱分析：通过对cDNA 3‘端或5’端特定区域的短序列进行计数来量化基因表达水平，成本较低且定量准确。

空间转录组学：在组织切片原位捕获并测序带有空间位置条形码的mRNA，从而获得基因表达的空间分布信息。

单细胞转录组测序：通过微流控、微孔板或液滴等技术分离单个细胞并构建其独立的cDNA文库，解析细胞群体的异质性。

检测仪器设备

Nanodrop/分光光度计：用于快速微量检测RNA样本的浓度（ng/μL）和纯度（A260/A280及A260/A230比值）。

Agilent Bioanalyzer/片段分析仪：基于微流控芯片电泳技术，精确评估总RNA完整性指数及cDNA文库的片段大小分布。

Qubit荧光定量仪：利用荧光染料特异性结合核酸的原理，对低浓度样本进行高灵敏度、高特异性的精确定量。

实时荧光定量PCR仪：用于文库模板的精确定量（qPCR定量法），以确保测序上样量的准确性，避免数据产出偏差。

Illumina NovaSeq系列测序仪：目前通量最高的二代测序平台之一，适用于超大规模转录组测序项目，能实现极高的数据产出和较低的每Gb成本。

Illumina HiSeq/MiSeq系列测序仪：成熟的二代测序平台，HiSeq适用于高通量项目，MiSeq适用于快速小通量测试或靶向测序。

PacBio Sequel II/IIe系统：三代单分子长读长测序仪，能够直接获得全长转录本序列，精确解析复杂剪接变异和融合基因。

Oxford Nanopore PromethION/GridION：便携式或高通量纳米孔测序仪，支持超长读长和直接RNA测序，提供实时数据分析能力。

10x Genomics Chromium控制器：基于微流控液滴技术的单细胞文库制备系统，可实现高通量、高捕获率的单细胞转录组建库。

高性能计算集群：由多台服务器组成的并行计算系统，配备大内存和多核CPU，用于存储海量测序数据并运行复杂的生物信息学分析流程。

检测流程

线上咨询或者拨打咨询电话;

获取样品信息和检测项目;

支付检测费用并签署委托书;

开展实验，获取相关数据资料;

出具检测报告。