反义寡核苷酸序列验证测试

检测项目

序列确认：通过质谱或测序技术，验证合成寡核苷酸的一级序列是否与设计完全一致。

纯度分析：测定目标全长ASO产物占总样品（包括失败序列、截短体等杂质）的百分比。

含量测定：精确测量样品中寡核苷酸的绝对含量或浓度，通常以OD260或质量浓度表示。

鉴别测试：利用色谱或光谱特性，确认样品为指定的目标ASO，区别于其他物质。

有关物质检查：定性或定量分析与主成分结构相关的杂质，如n-1、n+1序列、缺失碱基片段等。

对映体纯度：对于手性修饰的ASO（如硫代磷酸酯），检测其非对映异构体的比例。

游离核苷酸残留：检测合成过程中未完全结合的单个核苷酸原料或保护基的残留量。

修饰基团分析：验证设计引入的特定化学修饰（如2’-MOE, 2’-OMe, LNA等）是否成功且位置正确。

水分含量：测定样品中的水分，水分过高可能影响ASO的稳定性和定量准确性。

外观与溶解性：检查样品物理状态、颜色及在指定溶剂中的溶解情况，评估其物理性质。

检测范围

全长目标序列：具有完全正确序列和所有设计修饰的完整ASO分子，是检测和分析的核心对象。

短序列杂质：合成失败产生的比目标序列短的片段，如缺失一个或多个核苷酸的产物。

长序列杂质：因合成错误产生的比目标序列多一个或多个核苷酸的序列。

碱基缺失/插入片段：在合成过程中特定位置缺失或非设计插入碱基所产生的杂质序列。

修饰缺陷序列：在应进行化学修饰的位点未能成功修饰，或修饰类型错误的ASO变体。

非对映异构体：对于磷原子手性中心，产生与目标立体化学构型不同的异构体混合物。

工艺相关杂质：来自合成、纯化、储存过程的杂质，如有机溶剂、金属离子、酶残留等。

降解产物：在储存或处理过程中，ASO发生水解、氧化等化学降解产生的相关物质。

盐形式与反离子：分析ASO成品最终存在的盐形式（如钠盐、钾盐）及反离子含量。

微生物与内毒素：对于用于制药的ASO，需检测其微生物限度或无菌性以及细菌内毒素水平。

检测方法

高效液相色谱法：最常用的纯度与有关物质分析方法，包括离子对反相色谱和离子交换色谱。

质谱法：包括MALDI-TOF MS和ESI-MS，用于精确测定分子量以确认序列和修饰。

毛细管电泳法：基于电荷和大小分离，具有高分辨率，常用于纯度分析和杂质检测。

紫外光谱法：利用260nm附近的特征吸收峰进行ASO的鉴别和含量（浓度）的快速测定。

核磁共振波谱法：用于深入分析ASO的高级结构、修饰位点确认及对映体比例测定。

酶切图谱法：使用特异性核酸内切酶切割ASO，通过分析片段来间接验证序列和修饰。

杂交分析法：利用与互补序列的特异性杂交，验证ASO的序列身份和结合能力。

下一代测序法：对于复杂混合物或需要深度序列验证的情况，可提供高通量的序列信息。

离子色谱法：用于测定ASO样品中无机阴离子（如氯离子、磷酸根）和反离子的含量。

动态光散射法：评估ASO在溶液中的聚集状态和流体力学半径，间接反映其纯度与稳定性。

检测仪器设备

高效液相色谱仪：配备紫外/二极管阵列检测器或质谱检测器，用于分离和分析ASO及其杂质。

质谱仪：包括基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱和电喷雾电离质谱，用于精确分子量测定。

毛细管电泳仪：配备紫外或激光诱导荧光检测器，用于高分辨率的纯度分析和杂质筛查。

紫外-可见分光光度计：用于快速测量ASO样品在260nm处的吸光度，计算浓度和纯度初步评估。

核磁共振波谱仪：通常为高场强（如600 MHz及以上）仪器，用于结构解析和立体化学分析。

酶标仪/微孔板读数仪：可用于基于杂交或荧光标记的高通量ASO筛选和定量分析。

离子色谱仪：配备电导检测器，用于分析ASO样品中的无机离子和反离子含量。

动态光散射仪：用于测量ASO在溶液中的粒径分布和聚集状态，评估样品均一性。

水分测定仪：如卡尔费休滴定仪，用于精确测定ASO固体样品或溶液中的水分含量。

生物分析仪/片段分析仪：基于芯片式毛细管电泳，快速进行ASO的纯度、大小和浓度分析。

检测流程

线上咨询或者拨打咨询电话;

获取样品信息和检测项目;

支付检测费用并签署委托书;

开展实验，获取相关数据资料;

出具检测报告。