蛋白印迹实验验证

检测项目

总蛋白定量：在电泳前对提取的蛋白质样品进行浓度测定，确保上样量一致，是结果可比性的基础。

目标蛋白表达水平：检测特定蛋白在样本中的相对或绝对表达量，是Western Blot最核心的应用。

蛋白翻译后修饰：通过特异性抗体检测蛋白质的磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化等修饰状态。

蛋白剪切与活化：验证蛋白质前体（如Procaspase-3）是否被剪切为活性形式（如Cleaved Caspase-3）。

蛋白二聚体/多聚体形成：在非还原条件下，检测蛋白质是否通过二硫键或其他作用形成多聚体。

蛋白亚细胞定位指示：通过分离不同细胞组分（胞浆、胞核、线粒体等）的蛋白，间接推断目标蛋白的定位。

蛋白相互作用初步验证：与免疫共沉淀联用，验证免疫沉淀下来的复合物中是否存在特定的相互作用蛋白。

抗体特异性验证：通过敲低或敲除目标基因，观察信号是否消失，从而验证所用抗体的特异性。

疾病生物标志物检测：在临床或科研中，检测与特定疾病相关的标志性蛋白的表达变化。

药物或处理效应评估：评估药物处理、基因操作或环境刺激后，特定信号通路中关键蛋白的表达或修饰变化。

检测范围

细胞裂解液：来自培养的贴壁或悬浮细胞，是最常见的检测样本类型。

组织分浆液：来自动物或临床手术获取的组织样本，反映在体情况下的蛋白表达。

血清或血浆样本：用于检测分泌型蛋白或疾病相关的循环生物标志物。

细菌或酵母裂解物：用于原核或真核表达系统的蛋白表达鉴定和纯化分析。

植物组织提取物：应用于植物分子生物学研究，检测植物特定蛋白的表达。

亚细胞组分：如细胞核提取物、线粒体提取物、膜蛋白提取物等，用于定位研究。

免疫沉淀产物：经过抗体孵育和珠子沉淀后的样品，用于分析蛋白复合物。

重组蛋白样品：验证纯化后的重组蛋白的分子量、纯度和特异性。

病毒颗粒裂解物：研究病毒编码的蛋白或在病毒感染过程中宿主蛋白的变化。

脑脊液等其他体液：用于神经科学或临床研究，检测特定体液中的微量蛋白。

检测方法

样品制备与裂解：使用含有去垢剂、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的裂解液破碎细胞或组织，释放总蛋白。

BCA法或Bradford法定量：采用比色法精确测定蛋白质样品的浓度，以便计算统一的上样体积。

SDS-PAGE凝胶电泳：根据目标蛋白分子量配制合适浓度的聚丙烯酰胺凝胶，在电场作用下按分子量大小分离蛋白质。

蛋白质转膜：采用湿转或半干转法，将凝胶中分离的蛋白质转移到PVDF膜或硝酸纤维素膜上。

膜封闭：使用脱脂牛奶或BSA溶液封闭膜上的非特异性结合位点，减少后续抗体的非特异性吸附。

一抗孵育：用针对目标蛋白的特异性一抗与膜在4°C下孵育过夜或室温孵育数小时。

二抗孵育：用带有HRP或荧光基团的种属特异性二抗与一抗结合，室温孵育1-2小时。

化学发光法显影：对于HRP标记的二抗，使用ECL发光底物，在暗室或化学发光成像仪中曝光显影。

荧光法检测：对于荧光标记的二抗，使用特定波长的激光扫描成像，可进行多重检测。

内参蛋白校正：使用β-actin、GAPDH、Tubulin等看家蛋白抗体作为内参，对目标蛋白信号进行均一化校正。

检测仪器设备

垂直电泳槽：用于进行SDS-PAGE凝胶电泳，分离蛋白质的核心装置。

转印仪（转膜槽）：提供电场，将凝胶中的蛋白质转移至固相支持膜上的关键设备。

化学发光成像系统：高灵敏度CCD相机配合软件，用于捕获和定量分析化学发光信号。

荧光扫描成像仪：能够激发特定波长荧光并采集信号，适用于多重荧光Western Blot分析。

微量分光光度计：如NanoDrop，用于快速微量测定核酸或蛋白质样品的浓度。

高速低温离心机：用于快速沉降细胞碎片、收集亚细胞组分或免疫沉淀珠子。

水平摇床：用于转膜后膜的封闭、洗涤以及一抗、二抗的孵育过程，确保均匀接触。

精密移液器：涵盖从微升到毫升量程，用于精确移取样品、试剂和上样操作。

制冰机与-20°C/-80°C冰箱：用于制备低温环境，保存样品、抗体及试剂，维持其生物活性。

分析天平与pH计：用于精确称量化学试剂配制各种缓冲液，并精确调整其pH值。

检测流程

线上咨询或者拨打咨询电话;

获取样品信息和检测项目;

支付检测费用并签署委托书;

开展实验，获取相关数据资料;

出具检测报告。