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反义寡脱氧核苷酸化学修饰度检测
北检院检测中心 | 完成测试：次 | 2026-03-19
本检测详细阐述了反义寡脱氧核苷酸（AS-ODN）药物开发与质量控制中的关键环节——化学修饰度检测。文章系统性地介绍了该检测所涵盖的具体项目、适用的样品范围、当前主流的分析检测方法以及所需的精密仪器设备，旨在为相关领域的研究人员与质控人员提供全面的技术参考。
注意：因业务调整，暂不接受个人委托测试望见谅。
检测项目
全链长度确认：确认合成AS-ODN的核苷酸链长是否与设计序列完全一致，是基础质量指标。
硫代磷酸酯（PS）修饰度：定量检测磷酸二酯键被硫代磷酸酯键取代的比例，直接影响核酸酶抗性和药代动力学。
2'-O-甲基（2'-O-Me）修饰度：测定核糖2‘位氧原子上甲基化的核苷比例，关乎与靶RNA的结合亲和力及稳定性。
2'-O-甲氧乙基（2'-MOE）修饰度：检测引入2‘-MOE修饰的核苷比例，该修饰能显著增强稳定性和结合力。
锁核酸（LNA）掺入度：分析LNA单体在序列中的准确掺入比例，对提高熔解温度（Tm）和特异性至关重要。
5-甲基胞嘧啶（5-mC）修饰度：检测胞嘧啶5位甲基化的程度，可能影响寡核苷酸的稳定性和免疫原性。
末端帽结构（如胆固醇）连接率：测定用于增强细胞摄取或靶向性的末端功能基团（如胆固醇）的成功连接比例。
序列缺失/截短杂质：识别并定量比目标序列短的杂质，这些是合成过程中不完整链延伸的产物。
(n-1)及(n+1)序列杂质：检测比目标链少一个或多一个核苷酸的杂质，评估合成过程的保真度。
对映体纯度（Rp/Sp比例）：对于硫代修饰等产生手性中心的修饰，需检测非对映异构体的比例，因其生物活性可能不同。
检测范围
原料药（Drug Substance）：对合成后纯化前的粗品或纯化后的AS-ODN原料药本体进行全面的质量属性检测。
制剂成品（Drug Product）：对最终制成的注射液、冻干粉等剂型中的AS-ODN活性成分进行含量和修饰度确认。
工艺中间体：在固相合成或液相合成的关键步骤后取样，监控修饰反应的效率与一致性。
对照品/标准品：对用于定性和定量分析的高纯度标准物质进行标定和表征。
强制降解样品：对经过高温、强光、酸碱等强制降解处理的样品进行分析，评估修饰基团的稳定性。
加速稳定性样品：在药物稳定性研究中，定期抽取的样品需检测关键质量属性（如修饰度）的变化趋势。
生物样本提取物：从动物或临床试验的血浆、组织匀浆等样本中提取出的AS-ODN及其代谢产物。
合成树脂切割液：对从固相合成载体上切割下来的粗产物溶液进行初步分析，指导纯化工艺。
纯化收集馏分：在色谱纯化过程中，对各收集馏分进行快速分析，以确定目标产物的分布。
包装材料相容性研究样品：考察与直接接触的包装材料（如西林瓶、胶塞）共置后，AS-ODN的修饰度是否发生变化。
检测方法
离子对反相高效液相色谱法（IP-RP-HPLC）：最常用的方法，利用离子对试剂与带负电的骨架相互作用，基于疏水性分离不同修饰和长度的杂质。
阴离子交换高效液相色谱法（AEX-HPLC）：基于寡核苷酸所带负电荷数的差异进行分离，对硫代程度不同的杂质非常敏感。
毛细管凝胶电泳法（CGE）：基于分子筛原理，能高效分离长度差异仅一个核苷酸的杂质，是分析片段杂质的关键技术。
液相色谱-质谱联用法（LC-MS）：提供分子量确证和结构信息，是鉴定未知杂质、确认修饰类型和位置的黄金标准。
液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）：在LC-MS基础上提供更丰富的碎片离子信息，用于序列验证和复杂代谢产物分析。
紫外光谱法（UV）：通过特征吸收峰（如260nm）进行定量，并利用不同碱基或修饰基团的紫外谱图差异辅助分析。
核磁共振波谱法（NMR）：特别是31P NMR，可直接、无标地定量磷酸二酯键与硫代磷酸酯键的比例。
酶解液相色谱法：使用特定核酸酶将AS-ODN完全酶解为单核苷或短片段，通过分析水解产物来推算平均修饰度。
杂交液相色谱法：使AS-ODN与互补序列杂交后进行分析，可用于评估具有生物活性的完整链比例。
多角度光散射检测器联用法（如HPLC-MALS）：与HPLC联用，在线测定绝对分子量，独立验证链长和修饰引起的分子量变化。
检测仪器设备
高效液相色谱仪（HPLC）：核心分离设备，需配备二元或四元梯度泵、自动进样器、柱温箱和多种检测器。
三重四极杆液质联用仪（LC-MS/MS）：用于高灵敏度、高特异性的定性与定量分析，尤其是杂质鉴定和生物样本分析。
高分辨质谱仪（如Q-TOF, Orbitrap）：提供精确分子量测定，用于确认分子式、鉴别同分异构体和未知修饰。
毛细管电泳仪（CE）：专门用于CGE分析，配备紫外或激光诱导荧光检测器，实现高分辨率片段分析。
紫外-可见分光光度计：用于寡核苷酸溶液的浓度测定（A260）和纯度初步评估（A260/A280比值）。
核磁共振波谱仪（NMR）：特别是配备有31P探头的型号，用于直接定量磷酸骨架的硫代修饰比例。
多角度激光光散射检测器（MALS）：与HPLC系统在线连接，用于测定生物大分子的绝对分子量和均一性。
示差折光检测器（RID）：作为HPLC的通用型检测器，用于无紫外吸收或吸收弱的组分检测。
荧光检测器（FLD）：当AS-ODN带有荧光标记（如FAM、Cy系列）时，用于高灵敏度、高选择性的检测。
色谱数据系统（CDS）：控制仪器运行、采集数据并进行处理积分、生成报告的专业软件系统，是数据完整性的关键。
检测流程
线上咨询或者拨打咨询电话;
获取样品信息和检测项目;
支付检测费用并签署委托书;
开展实验，获取相关数据资料;
出具检测报告。
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