蛋白免疫印迹实验

检测项目

目标蛋白表达水平：检测特定蛋白在细胞或组织样本中的相对或绝对表达量，是Western Blot最核心的应用。

蛋白翻译后修饰：通过特异性抗体检测蛋白的磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化等修饰状态。

蛋白亚细胞定位指示：通过分离不同细胞组分（如胞浆、胞核、线粒体）的蛋白，间接推断目标蛋白的定位。

蛋白复合物形成：通过免疫共沉淀（Co-IP）结合Western Blot，验证蛋白间的相互作用。

蛋白剪切与活化：检测如Caspase、PARP等蛋白的剪切片段，或激酶活化环的磷酸化，以指示其活性状态。

蛋白二聚化/多聚化：在非还原条件下进行电泳，可以检测由二硫键连接的同源或异源多聚体。

转基因或基因敲除验证：在分子生物学实验中，用于验证外源基因的表达或内源基因的敲除/敲低效率。

抗体特异性验证：作为验证抗体特异性的金标准方法之一，通过预测分子量大小和敲除/敲低样本进行确认。

疾病生物标志物筛选：在临床研究和基础医学中，用于筛选和验证与疾病发生发展相关的差异表达蛋白。

药物作用机制研究：通过分析药物处理后信号通路关键蛋白表达或修饰的变化，阐明药物的潜在作用靶点。

检测范围

细胞裂解液：来自培养的贴壁或悬浮细胞，是最常用的样本类型，可进行多种处理。

动物组织匀浆液：来自小鼠、大鼠等实验动物的心脏、肝脏、脑、肿瘤等组织。

植物组织提取物：适用于研究植物生理、病理及遗传改良相关的蛋白表达。

细菌或酵母裂解物：用于原核或真核微生物的蛋白表达研究及重组蛋白检测。

血清或血浆样本：可用于检测体液中的特异性抗体、细胞因子或疾病相关抗原。

脑脊液或其他体液：在神经科学或临床诊断中，检测特定生物标志物。

亚细胞组分：如线粒体、细胞核、胞浆、膜蛋白等分离后的组分，用于定位研究。

免疫沉淀产物：经过Co-IP或ChIP实验富集后的蛋白复合物或特定DNA结合蛋白。

重组蛋白：用于鉴定纯化后的重组蛋白的纯度、浓度及特异性。

病毒颗粒蛋白：分析病毒结构蛋白或病毒编码的调控蛋白的表达情况。

检测方法

样本制备与定量：使用裂解液提取总蛋白，并通过BCA法或Bradford法进行精确定量，确保上样量一致。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：根据目标蛋白分子量选择合适浓度的凝胶，在电场作用下按分子量大小分离蛋白。

转膜：将凝胶中分离的蛋白通过湿转或半干转方式转移到PVDF膜或硝酸纤维素膜上。

封闭：使用脱脂牛奶或BSA溶液封闭膜上的非特异性结合位点，减少背景信号。

一抗孵育：用针对目标蛋白的特异性一抗与膜在4°C下孵育过夜或室温孵育1-2小时。

洗膜：使用TBST或PBST缓冲液洗涤膜，去除未结合的一抗，降低非特异性背景。

二抗孵育：用带有HRP或荧光基团的种属特异性二抗室温孵育膜1小时左右，用于信号放大和检测。

化学发光显影：对于HRP标记的二抗，使用ECL发光底物孵育后，在暗室或化学发光成像仪中曝光采集信号。

荧光检测：对于荧光标记的二抗，直接在荧光成像仪中使用特定波长激发和发射光进行扫描。

内参蛋白检测与数据分析：使用β-actin、GAPDH、Tubulin等内参抗体检测上样量，通过软件分析目标条带与内参条带的灰度值进行半定量。

检测仪器设备

垂直电泳槽：用于进行SDS-PAGE，配备玻璃板、梳子等，形成凝胶并完成电泳分离。

电源供应器：为SDS-PAGE电泳和转膜过程提供稳定、可调节的电压和电流。

转印装置：包括湿转转印槽或半干转转印仪，配备电极板和海绵/滤纸，用于将蛋白从凝胶转移至膜上。

摇床：用于封闭、抗体孵育和洗膜过程中的温和振荡，确保反应均匀充分。

化学发光成像系统：核心检测设备，配备高灵敏度CCD相机和暗箱，用于捕获和记录ECL化学发光信号。

荧光成像系统：配备特定激光器和滤光片组，用于检测荧光标记二抗发出的信号，可进行多色荧光检测。

凝胶成像系统（可选）：用于观察考马斯亮蓝染色或银染后的凝胶，评估总蛋白上样情况。

微量分光光度计/酶标仪

检测流程

线上咨询或者拨打咨询电话;

获取样品信息和检测项目;

支付检测费用并签署委托书;

开展实验，获取相关数据资料;

出具检测报告。