泛素化修饰免疫印迹测试

检测项目

总蛋白泛素化水平检测：通过识别多聚泛素链或泛素分子，检测细胞或组织裂解液中整体蛋白质的泛素化修饰程度。

特定靶蛋白泛素化检测：针对某个已知的靶蛋白（如p53、IKBα），利用其特异性抗体检测其是否被泛素化修饰。

泛素链连接类型鉴定：使用特异性识别K48、K63等不同连接方式泛素链的抗体，确定泛素化的功能类型。

单泛素化与多聚泛素化区分：通过分子量差异和特异性抗体，区分靶蛋白上是连接单个泛素分子还是多聚泛素链。

E3连接酶活性间接评估：通过检测其已知底物蛋白的泛素化水平变化，来间接反映特定E3泛素连接酶的活性。

去泛素化酶活性检测：通过比较去泛素化酶处理前后底物蛋白的泛素化水平，评估其酶活性。

蛋白酶体降解途径验证：结合蛋白酶体抑制剂处理，观察靶蛋白泛素化水平的累积，验证其是否通过泛素-蛋白酶体途径降解。

应激条件下的泛素化响应：检测在热休克、氧化应激或DNA损伤等条件下，细胞整体或特定通路蛋白泛素化模式的变化。

蛋白质复合物泛素化状态分析：免疫共沉淀后，对沉淀下来的蛋白质复合物进行泛素化印迹分析，研究复合物成员的修饰情况。

翻译后修饰交叉对话研究：探究磷酸化、乙酰化等其他修饰对特定蛋白质泛素化修饰的影响及相互调控关系。

检测范围

细胞系样本：适用于各种贴壁或悬浮培养的哺乳动物细胞系、昆虫细胞系等，是机制研究的主要材料。

动物组织样本：可从小鼠、大鼠等模式动物的心脏、肝脏、脑等组织中提取蛋白，用于在体研究。

临床组织样本：适用于手术切除的肿瘤组织、病理活检组织等，用于疾病相关的生物标志物研究。

原代培养细胞：对直接从组织中分离培养的细胞进行检测，结果更接近体内真实情况。

植物样本：适用于拟南芥、水稻等模式植物组织，研究植物体内的泛素化过程。

酵母样本：利用酵母这种简单的真核模式生物，进行泛素化通路的基础生物学研究。

体外泛素化反应体系：对包含纯化的E1、E2、E3酶、底物蛋白和ATP的体外反应产物进行检测。

免疫沉淀或亲和纯化产物：对经过抗体或标签富集后的特定蛋白或蛋白复合物进行高灵敏度检测。

亚细胞组分蛋白：对通过分级离心分离得到的细胞核、线粒体、胞浆等组分蛋白分别进行检测。

分泌蛋白与外泌体蛋白：适用于细胞上清或纯化的外泌体样本中蛋白质的泛素化修饰分析。

检测方法

RIPA裂解法提取总蛋白：使用含有去垢剂和抑制剂的RIPA裂解液破碎细胞，释放总蛋白并抑制去泛素化酶活性。

变性凝胶电泳：使用SDS-PAGE将蛋白质根据分子量大小进行分离，确保泛素化引起的分子量增加得以区分。

湿转或半干转印迹：将凝胶中分离的蛋白质转移至PVDF或NC膜上，以便进行抗体孵育和检测。

抗泛素抗体孵育：使用识别泛素、多聚泛素链或特定连接类型泛素链的一抗进行孵育，特异性结合目标条带。

靶蛋白抗体共孵育或剥离重孵：在同一张膜上先后使用抗泛素抗体和抗靶蛋白抗体孵育，或进行剥离后重新孵育，以共定位验证。

化学发光法显影：使用HRP标记的二抗与一抗结合，并通过ECL发光底物在暗室中曝光X光胶片或使用成像系统采集信号。

内参蛋白检测：使用β-actin、GAPDH或Tubulin等内参蛋白抗体检测上样量，用于数据标准化和定量分析。

蛋白酶体抑制剂预处理：在细胞培养中加入MG132、Bortezomib等抑制剂，阻断蛋白酶体降解，使泛素化蛋白累积以便检测。

免疫共沉淀富集法：先用靶蛋白抗体进行免疫沉淀，再用泛素抗体进行Western Blot，提高低丰度靶蛋白泛素化检测灵敏度。

Ni-NTA pull-down法：对组氨酸标签标记的泛素转染细胞裂解液进行镍柱亲和纯化，特异性富集泛素化蛋白进行检测。

检测仪器设备

垂直电泳槽：用于进行SDS-PAGE凝胶电泳，分离不同分子量的蛋白质样品。

转印电泳槽：用于将凝胶中分离的蛋白质通过电转移方式转印至固相膜载体上。

半干转印仪：提供快速高效的半干式转印，节省转膜缓冲液并缩短转印时间。

化学发光成像系统：高灵敏度CCD相机成像仪，用于捕获和定量分析ECL化学发光信号。

X光胶片曝光暗盒：传统但可靠的信号记录工具，需配合X光胶片和自动洗片机使用。

水平摇床：用于Western Blot过程中膜的一抗、二抗孵育及洗膜步骤，确保均匀接触。

精密电子天平：用于准确称量药品、试剂，配制各种缓冲液、丙烯酰胺凝胶等。

pH计：用于精确测量和调整各种电泳缓冲液、转膜缓冲液的pH值，保证实验重复性。

低温高速离心机：用于快速低温离心沉淀细胞、收集蛋白样品，防止蛋白降解。

超声波细胞破碎仪：用于强力破碎某些难以裂解的细胞或组织样本，充分释放细胞内蛋白。

检测流程

线上咨询或者拨打咨询电话;

获取样品信息和检测项目;

支付检测费用并签署委托书;

开展实验，获取相关数据资料;

出具检测报告。