化学交联质谱测试

检测项目

交联肽段鉴定：通过质谱数据搜索，精准识别经化学交联剂连接的两个肽段所形成的共价交联产物。

交联位点定位：在已鉴定的交联肽段中，精确确定发生交联反应的具体氨基酸残基位置。

蛋白质相互作用界面分析：基于密集的交联位点信息，绘制蛋白质复合物中分子间的接触面与结合区域。

蛋白质三维结构建模与验证：利用交联距离约束信息（通常为两个Cα原子间的空间距离上限），辅助计算或验证蛋白质的三维结构模型。

蛋白质构象变化监测：比较不同功能状态下（如配体结合前后）的交联谱图差异，揭示蛋白质的动态构象变化。

蛋白质复合物组成与拓扑学分析：解析多亚基蛋白质复合物的组成成分以及各组分之间的相对空间排列关系。

膜蛋白相互作用研究：特别适用于研究难以结晶的膜蛋白及其复合物的相互作用网络。

细胞内原位交联分析：对活细胞内的蛋白质进行原位交联，捕获生理状态下瞬时的、弱性的相互作用。

交联剂反应效率评估：评估不同化学交联剂与特定蛋白质体系的反应效率和选择性。

定量化学交联分析：结合稳定同位素标记等技术，对不同样品间的交联产物进行定量比较。

检测范围

可溶性球蛋白及其复合物：适用于研究细胞质、核内等可溶环境中的单体蛋白或多蛋白复合物。

膜蛋白与膜蛋白复合物：广泛应用于跨膜蛋白、膜锚定蛋白及其相互作用网络的结构解析。

大型分子机器：如核糖体、剪接体、蛋白酶体等复杂超分子组装体的结构拓扑研究。

染色质相关蛋白复合物：用于分析组蛋白修饰、转录因子与DNA形成的染色质高级结构。

细胞骨架网络蛋白：研究肌动蛋白、微管蛋白等骨架蛋白的组装与相互作用。

病毒衣壳蛋白与宿主蛋白互作：揭示病毒组装机制及病毒蛋白与宿主细胞蛋白的相互作用界面。

药物-靶标蛋白相互作用表征：通过交联图谱的变化，分析小分子药物如何影响靶蛋白的构象及与其伙伴蛋白的结合。

蛋白质与核酸（DNA/RNA）相互作用：使用可同时与蛋白质和核酸反应的异型双功能交联剂，研究核糖核蛋白复合物。

细胞裂解液或纯化样品中的蛋白质组：从复杂混合物中规模化地鉴定蛋白质相互作用网络。

完整细胞或组织原位交联样品：在接近生理状态的完整体系内，捕获全局性的蛋白质相互作用图谱。

检测方法

样品制备与交联反应：优化蛋白质纯度、浓度、缓冲液条件，加入特定化学交联剂（如DSSO、BS3）进行可控反应后淬灭。

酶解消化：通常使用胰蛋白酶等蛋白酶将交联后的蛋白质消化成肽段混合物，包括未交联肽段、单边连接肽段和交联肽段。

肽段分级分离：利用强阳离子交换色谱、高pH反相色谱或尺寸排阻色谱等方法，降低样品复杂度，富集交联肽段。

液相色谱-串联质谱分析：采用纳升液相色谱与高分辨率串联质谱联用技术，对肽段混合物进行分离与序列鉴定。

数据依赖采集模式：最常用的质谱扫描模式，对前体离子进行碎裂，获得肽段的二级质谱图用于鉴定。

数据非依赖采集模式：如SWATH-MS，可对所有离子进行无偏的碎裂和检测，有利于提高重现性和定量准确性。

交联肽段数据库搜索：使用专门的搜索软件（如pLink, XlinkX, MeroX），在考虑交联剂质量、裂解规律的基础上，从质谱数据中鉴定交联肽段。

假阳性率控制与结果过滤：通过设定严格的打分阈值、诱饵数据库搜索和手动验证等方式，确保鉴定结果的可靠性。

交联距离约束提取与整合：将鉴定到的交联位点转换为空间距离约束（通常为~30 Å），输入到分子建模软件中。

结构建模与数据分析可视化：利用HADDOCK、Rosetta等软件整合交联约束进行结构计算，并使用Chimera等工具进行可视化分析。

检测仪器设备

高分辨率串联质谱仪：如Q-Exactive系列、Orbitrap Fusion系列、timsTOF系列等，提供高质量精度和分辨率的前体离子与碎片离子信息。

纳升液相色谱系统：用于在质谱分析前对复杂肽段混合物进行高效分离，提高鉴定深度和灵敏度。

化学交联剂：核心试剂，如胺反应性的同型双功能交联剂（DSS、BS3）、可裂解交联剂（DSSO）、光活化交联剂等。

超声波细胞破碎仪或高压均质机：用于处理细胞或组织样品，提取蛋白质并进行原位交联后的裂解。

高速离心机与超速离心机：用于样品的澄清、细胞器分离以及膜蛋白的制备。

SDS-PAGE或琼脂糖凝胶电泳系统：用于交联反应效率的初步评估和样品预分离。

肽段分级色谱系统：如离线或在线操作的SCX、高pH RP色谱系统，用于降低样品复杂度。

数据库搜索服务器与工作站：运行大规模质谱数据搜索和生物信息学分析所需的高性能计算设备。

结构建模与可视化软件：如HADDOCK、CNS/XPLOR、PyMOL、UCSF Chimera等，用于整合数据并生成三维模型。

实验室常规设备：包括pH计、精密天平、恒温摇床、真空离心浓缩仪等，保障样品前处理过程的精确与稳定。

检测流程

线上咨询或者拨打咨询电话;

获取样品信息和检测项目;

支付检测费用并签署委托书;

开展实验，获取相关数据资料;

出具检测报告。