蛋白复合物凝胶阻滞试验

检测项目

DNA-蛋白质相互作用验证：验证特定转录因子或DNA结合蛋白是否能与一段已知序列的DNA探针特异性结合。

RNA-蛋白质相互作用验证：检测RNA结合蛋白（RBP）与特定RNA序列或结构元件之间的结合能力。

结合亲和力比较：通过竞争实验，比较不同突变体探针或不同蛋白样品与靶序列的相对结合强度。

复合物组分鉴定：利用超迁移或抗体超迁移实验，鉴定参与形成蛋白-核酸复合物的具体蛋白质组分。

结合位点定位：通过使用一系列截短或突变的核酸探针，初步确定蛋白质结合所必需的核心序列或结构域。

二价阳离子依赖性检测：探究Mg²⁺、Zn²⁺等二价阳离子对蛋白-核酸复合物形成及稳定性的影响。

抑制剂或药物筛选：评估小分子化合物、药物或提取物是否能干扰或阻断特定的蛋白-核酸相互作用。

动力学参数估算：结合定量分析，可粗略估算解离常数（Kd），用于评估相互作用的强弱。

复合物化学计量分析：通过分析条带迁移率的变化，推断一个复合物中蛋白质单体与核酸分子的结合比例。

核提取物中结合活性分析：直接使用细胞核提取物进行实验，检测在接近生理条件下特定转录因子的DNA结合活性。

检测范围

转录调控研究：广泛应用于研究转录因子与其顺式作用元件（如启动子、增强子）的相互作用。

基因沉默与表观遗传：用于分析甲基化CpG结合蛋白、染色质重塑复合物等与修饰后DNA的相互作用。

RNA加工与代谢：研究剪接因子、转运蛋白、稳定性调节蛋白与pre-mRNA或mRNA非翻译区的结合。

病毒学：检测病毒编码的调控蛋白与病毒基因组或宿主细胞核酸的特异性结合。

微生物学：研究细菌调控蛋白与操纵子、启动子区域的结合，阐明原核基因表达调控网络。

药物靶点验证：确认以特定蛋白-核酸相互作用为靶点的候选药物的体外作用效果。

信号通路分析：探究信号转导事件如何影响下游转录因子的DNA结合活性（如磷酸化影响）。

发育生物学：用于分析在胚胎发育过程中起关键作用的形态发生素或转录因子与靶基因的调控关系。

癌症研究：研究癌基因或抑癌基因产物（如突变型p53）异常核酸结合活性在肿瘤发生中的作用。

植物分子生物学：研究植物抗逆、开花等生理过程中关键转录因子与响应元件的互作。

检测方法

探针设计与标记：合成或制备目标DNA/RNA片段，通常使用放射性同位素（³²P）或非放射性（生物素、地高辛）进行末端标记。

蛋白样品制备：准备纯化的重组蛋白、部分纯化的蛋白组分或细胞核提取物作为结合反应的蛋白来源。

结合反应体系建立：将标记探针与蛋白样品在适宜缓冲条件下孵育，使复合物形成。缓冲液常含poly(dI-dC)等非特异性竞争剂。

非变性凝胶电泳：将结合反应产物上样至非变性聚丙烯酰胺凝胶中，在低温下进行电泳。游离探针迁移快，蛋白-探针复合物迁移慢。

竞争性实验：在反应中加入过量未标记的野生型或突变型竞争探针，以验证结合的特异性。

超迁移实验：在反应中加入针对疑似复合物组分的特异性抗体，若形成更大的“超迁移”复合物条带，则证实该蛋白存在。

化学交联：有时使用化学交联剂固定不稳定的复合物，以增强其在电泳过程中的稳定性。

凝胶干燥与成像：电泳后，将凝胶干燥在滤纸上（放射性标记），或转膜（非放射性标记），然后通过相应方法成像。

信号检测与分析：使用磷屏成像仪（放射性）、化学发光成像系统（生物素/地高辛）或荧光扫描仪（荧光标记）检测并分析条带信号强度。

定量分析：利用图像分析软件对条带灰度值进行定量，计算结合百分比、抑制率或进行竞争曲线拟合以估算Kd值。

检测仪器设备

垂直电泳槽系统：用于灌制和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的核心设备，需具备良好的冷却功能。

高精度移液器：用于精确移取微量反应组分，确保结合反应体系的准确性和重复性。

恒温孵育器或水浴锅：用于控制结合反应孵育过程的温度，通常在室温或4℃进行。

凝胶成像系统：根据标记方法选择，如磷屏成像仪用于放射性信号，化学发光/荧光成像仪用于非放射性信号。

真空凝胶干燥机：用于将电泳后的凝胶干燥在滤纸上，便于长期保存和放射性自显影。

半干式或湿式转印仪：当使用非放射性标记并需要转膜检测时必备的设备。

紫外交联仪或紫外观测仪：用于观察和切割未标记的DNA片段，或在某些实验中进行紫外交联。

高速离心机与微量离心机：用于制备细胞核提取物、浓缩蛋白样品以及快速离心收集反应液。

振荡混合器：用于充分混匀结合反应体系及电泳上样前的样品。

暗房设备或安全柜：若使用放射性同位素标记，需在专用暗房或安全柜内进行相关操作，以保障安全。

检测流程

线上咨询或者拨打咨询电话;

获取样品信息和检测项目;

支付检测费用并签署委托书;

开展实验，获取相关数据资料;

出具检测报告。