蛋白质印迹通路验证

检测项目

目标蛋白总表达量：检测信号通路中关键蛋白的基础表达水平，作为磷酸化水平变化的参照。

磷酸化蛋白水平：核心检测项目，使用特异性磷酸化抗体验证信号通路是否被激活或抑制。

通路关键激酶：如Akt、ERK、JNK等，验证其在特定刺激下的活性状态或表达变化。

通路转录因子：如NF-κB、STATs等，检测其核转位或磷酸化修饰，评估通路下游效应。

上游受体或配体：验证刺激源头，如生长因子受体（EGFR）的激活状态。

衔接蛋白与支架蛋白：如IRS-1、Grb2等，分析信号复合物的形成与功能。

凋亡相关蛋白：如Caspase-3、PARP的剪切体，验证凋亡通路是否被激活。

细胞周期调控蛋白：如Cyclin D1、p21等，评估通路对细胞增殖的影响。

内参蛋白：如β-Actin、GAPDH、Tubulin，用于校正上样量，确保结果可比性。

修饰特异性蛋白变体：如泛素化、乙酰化修饰的蛋白，探索信号调控的多样性。

检测范围

生长因子信号通路：如PI3K/Akt/mTOR通路、MAPK/ERK通路，研究细胞增殖与存活。

细胞应激与凋亡通路：如p53通路、JAK/STAT通路、死亡受体通路，响应DNA损伤或外界压力。

免疫与炎症通路：如NF-κB通路、TLR信号通路，在免疫细胞激活和炎症反应中起核心作用。

代谢相关通路：如AMPK通路、胰岛素信号通路，调控细胞能量代谢与稳态。

发育与分化通路：如Wnt/β-catenin通路、Hedgehog通路，影响胚胎发育和组织定向分化。

GPCR下游信号通路：验证G蛋白偶联受体激活后对cAMP、Ca2+等第二信使及下游效应器的影响。

DNA损伤修复通路：如ATM/ATR-Chk通路，检测磷酸化事件以评估DNA损伤响应。

自噬相关通路：如LC3-I向LC3-II的转化，以及p62的降解，用于监测自噬流。

神经信号通路：如Trk受体介导的神经元存活与分化通路。

肿瘤发生相关通路：综合多条通路，用于癌症机制研究及靶向药物疗效评估。

检测方法

细胞培养与处理：对细胞进行特定刺激（如生长因子、药物、缺氧）或基因操作（如过表达、敲低），以扰动目标通路。

蛋白样品制备：使用RIPA裂解液提取总蛋白，并加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂以保持蛋白修饰状态。

BCA法蛋白定量：精确测定蛋白浓度，确保后续实验各泳道上样量一致。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：根据目标蛋白分子量选择合适浓度的凝胶，使蛋白按分子量大小分离。

湿转或半干转印迹：将凝胶中分离的蛋白转移至PVDF或NC膜上，形成固相支持物。

膜封闭：使用5%脱脂牛奶或BSA溶液封闭膜上的非特异性结合位点，减少背景。

一抗孵育：使用针对目标蛋白（特别是磷酸化位点）的特异性一抗，在4℃下孵育过夜。

二抗孵育：使用与一抗种属匹配的HRP或荧光标记的二抗，室温孵育1-2小时。

化学发光或荧光显影：添加ECL发光底物或使用荧光扫描仪，检测信号并成像。

图像分析与数据统计：使用Image J等软件量化条带灰度值，将目标蛋白信号与内参对比，进行统计学分析。

检测仪器设备

垂直电泳槽：用于进行SDS-PAGE，实现蛋白样品的按分子量初步分离。

转印仪：包含转印槽和电源，用于将凝胶中的蛋白高效、均匀地转印至膜上。

半干转印系统：作为湿转的替代方案，转印速度快，但适用于分子量适中的蛋白。

精密电子天平：用于精确称量化学试剂、药品，配制各种缓冲液和凝胶。

pH计：确保电泳缓冲液、转印缓冲液等关键试剂的pH值准确，影响实验重复性。

高速低温离心机：用于细胞、组织样本的快速离心收集，以及在低温下制备蛋白样品。

涡旋振荡器与超声破碎仪：用于充分混匀样品，或破碎组织、细胞以释放蛋白。

酶标仪或分光光度计：配备微孔板，通过BCA法或Bradford法快速测定多个蛋白样品的浓度。

化学发光成像系统或荧光扫描仪：核心检测设备，用于捕获和记录膜上的蛋白信号图像。

图像分析软件：如Image Lab、Image J，对成像后的条带进行定量分析，获取灰度值数据。

检测流程

线上咨询或者拨打咨询电话;

获取样品信息和检测项目;

支付检测费用并签署委托书;

开展实验，获取相关数据资料;

出具检测报告。