凝胶层析分子量分析

检测项目

蛋白质分子量测定：测定纯化或混合蛋白质样品中目标蛋白的表观分子量，是评估蛋白质纯度和均一性的关键指标。

蛋白质聚合体分析：检测蛋白质样品中是否存在二聚体、多聚体或高级聚集物，对评估药物蛋白的稳定性至关重要。

核酸片段大小分析：用于分析DNA限制性片段、PCR产物或RNA的片段大小分布，在分子克隆中应用广泛。

多糖分子量分布：测定多糖样品的重均分子量、数均分子量及多分散系数，表征其均一性。

抗体片段分析：分析抗体酶切后产生的Fab、Fc等片段的大小，或评估完整抗体的聚合状态。

病毒样颗粒尺寸分析：基于流体力学体积，评估病毒样颗粒或纳米颗粒的组装大小和均一度。

蛋白质-配体相互作用：通过分子量变化，初步判断蛋白质是否与小分子或其它生物大分子发生结合。

膜蛋白去垢剂胶束分析：测定溶解在去垢剂中的膜蛋白与去垢剂形成的复合物总大小，用于优化纯化条件。

重组蛋白产物表征：作为生物药开发中的一项关键物化表征，确认目标蛋白的分子大小是否符合预期。

柱状胶校准曲线建立：使用标准品绘制洗脱体积对数值与分子量对数值的标准曲线，为后续样品分析提供依据。

检测范围

球蛋白：适用于大多数水溶性球状蛋白的分子量测定，范围通常在几千到几十万道尔顿。

纤维蛋白：可用于分析胶原蛋白等纤维状蛋白，但其非球形结构可能导致表观分子量估算偏差。

质粒DNA：能够分离不同构型的质粒DNA（超螺旋、开环、线性），并估算其分子大小。

寡核苷酸：适用于较长链的寡核苷酸（如引物、探针）的纯度检查和粗略大小分析。

蛋白聚糖：可用于分析糖胺聚糖链与核心蛋白共价结合形成的大分子复合物。

合成聚合物：部分亲水性合成聚合物，如聚乙二醇、聚乙烯醇等，也可用此方法分析。

脂质体：基于尺寸排阻原理，可以分析脂质体囊泡的粒径分布情况。

蛋白质变性状态分析：在变性剂存在下，可测定蛋白质变性展开后的分子尺寸，用于研究变性过程。

酶反应复合物：用于分析酶与底物、抑制剂形成的瞬时复合物的分子量变化。

血清抗体：可用于分析血清样本中不同类别免疫球蛋白的分布情况。

检测方法

标准曲线法：使用已知分子量的标准蛋白质混合物上样，绘制标准曲线，根据未知样品的洗脱体积在曲线上查找其分子量。

相对保留时间法：在固定色谱条件下，比较样品与标准品的洗脱时间，快速判断分子量范围。

在线多角度光散射联用法：将凝胶层析与MALS检测器联用，无需标准曲线即可直接、绝对地测定分子量。

示差折光与紫外联用：同时使用示差折光检测器和紫外检测器，可同时检测浓度并进行定量分析。

静态批处理法：将凝胶颗粒与样品溶液混合，离心后分析上清，快速估算分子量范围，适用于预实验。

分级收集分析法：按时间或体积收集洗脱组分，然后对每个组分进行后续生化分析，如SDS-PAGE、活性测定。

变性条件层析：在流动相中添加变性剂，使蛋白质以伸展状态分离，主要用于分析含有二硫键的蛋白。

非变性条件层析：在保持蛋白质天然构象的缓冲条件下进行，用于分析天然状态下的分子大小和相互作用。

分子排阻色谱法：即凝胶层析的规范色谱学名称，强调其基于尺寸排阻的色谱分离机理。

校准品选择与匹配：根据待测样品性质选择匹配的标准品，如用球蛋白标准测球蛋白，用葡聚糖标准测多糖。

检测仪器设备

高效液相色谱系统：提供稳定的高压输液系统，是进行高效凝胶层析的核心平台。

凝胶过滤色谱柱：填充有不同分离范围的亲水凝胶介质的色谱柱，如基于葡聚糖、琼脂糖或聚合物的填料。

紫外-可见光检测器：最常用的在线检测器，通过280nm或214nm波长检测蛋白质等具有紫外吸收的样品。

示差折光检测器：通用型浓度检测器，可检测无紫外吸收的样品，如多糖、聚乙二醇。

多角度激光光散射检测器：与SEC联用，可直接测定绝对分子量、均方根半径及聚集状态。

在线粘度检测器：与SEC联用，用于测定特性粘度，研究分子的结构、构象和支化度。

自动进样器：实现高通量、重复性好的样品自动进样，提高实验效率和准确性。

柱温箱：用于精确控制色谱柱温度，确保分离过程的重现性，特别是对温度敏感的样品。

馏分收集器：用于自动收集色谱柱洗脱出的组分，以便进行后续的离线分析。

数据采集与处理系统：专用的色谱工作站软件，用于控制仪器、采集数据、绘制标准曲线和计算分子量。

检测流程

线上咨询或者拨打咨询电话;

获取样品信息和检测项目;

支付检测费用并签署委托书;

开展实验，获取相关数据资料;

出具检测报告。