细胞凋亡 Annexin V/PI 双染检测

检测项目

细胞凋亡率定量分析：通过流式细胞术定量检测样本中发生凋亡的细胞（包括早期和晚期凋亡）占总细胞群体的百分比。

早期凋亡细胞检测：特异性识别磷脂酰丝氨酸外翻但细胞膜完整的细胞，即Annexin V阳性而PI阴性的细胞群体。

晚期凋亡/坏死细胞检测：识别细胞膜完整性已丧失的细胞，即Annexin V和PI均为阳性的细胞群体。

活细胞比例测定：确定样本中未被染色的健康细胞（Annexin V和PI均为阴性）所占的比例。

细胞坏死评估：辅助区分因非凋亡途径（如物理损伤）导致的细胞死亡，通常表现为Annexin V阴性而PI阳性。

药物诱导凋亡效应评价：评估化疗药物、靶向药物或其他化合物诱导细胞发生凋亡的效能和剂量依赖性。

凋亡通路机制研究：结合特定抑制剂或激动剂，研究不同信号通路（如线粒体通路、死亡受体通路）在凋亡中的作用。

细胞周期与凋亡关联分析：可与其他染料（如DAPI）联用，分析处于不同细胞周期阶段的细胞的凋亡敏感性。

免疫细胞功能检测：应用于免疫学领域，检测T细胞、B细胞等免疫细胞的活化诱导凋亡或耗竭状态。

肿瘤细胞耐药性研究：比较耐药株与敏感株在药物处理后凋亡率的差异，评估肿瘤细胞的耐药特性。

检测范围

悬浮培养细胞系：适用于如Jurkat、U937、HL-60等悬浮生长的血液系统或免疫系统来源的细胞系。

贴壁培养细胞系：适用于如HeLa、A549、MCF-7等贴壁生长的实体瘤或组织来源的细胞系，需经温和消化处理。

原代培养细胞：适用于从血液、骨髓或组织中分离培养的原代细胞，如外周血单个核细胞、原代肝细胞等。

植物原生质体：经过适当方法制备的植物原生质体也可采用此原理进行细胞死亡检测。

酵母细胞：适用于研究酵母细胞的程序性死亡过程，但试剂和条件需进行特定优化。

临床血液样本：直接或经分离后用于检测患者外周血或骨髓中的白血病细胞、淋巴细胞的凋亡情况。

组织单细胞悬液：通过机械分离或酶消化法制备的实体组织单细胞悬液，可用于检测组织内细胞的凋亡。

药物筛选与毒性测试：广泛应用于制药行业，用于高通量筛选具有促凋亡活性的候选药物或评估化合物细胞毒性。

肿瘤放射生物学研究：用于评估不同剂量辐射对肿瘤细胞凋亡的诱导作用及放射增敏剂的效果。

发育生物学研究：用于观察胚胎发育、器官形成过程中发生的生理性细胞凋亡（如指蹼消失）。

检测方法

细胞收集与洗涤：轻柔收集处理组与对照组细胞，用预冷的PBS缓冲液洗涤1-2次，彻底去除培养基中的血清（含PS）。

细胞重悬与计数：用适量的1×结合缓冲液重悬细胞，并进行细胞计数，调整细胞浓度至1×10^6/mL左右。

Annexin V荧光标记：向细胞悬液中加入荧光素（如FITC、PE、APC）标记的Annexin V，避光室温孵育10-15分钟。

碘化丙啶（PI）染色：在孵育结束前，加入PI染色液（终浓度通常为1-5 μg/mL），混匀后立即上机检测或置于冰上。

设置对照管：必须设置未染色细胞对照、单染Annexin V对照、单染PI对照，用于流式细胞仪的荧光补偿调节。

避光操作：整个染色过程应在避光条件下进行，以防止荧光淬灭，保证检测结果的准确性。

及时上机检测：染色完成后，应在1小时内进行流式细胞仪检测，时间过长会导致细胞状态变化和染色背景加深。

流式细胞仪获取数据：使用流式细胞仪，通过前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）设门排除碎片，采集至少10,000个细胞事件。

数据分析与设门：利用分析软件，根据对照管调节补偿，在双变量散点图上划分四个象限，分别代表不同状态的细胞群。

结果计算与报告：计算各象限细胞百分比，重点报告早期凋亡率（右下象限）和总凋亡率（右下+右上象限）。

检测仪器设备

流式细胞仪：核心检测设备，能够快速、多参数地对单个细胞进行荧光信号分析和分选。

细胞培养箱：用于提供恒定的温度（37℃）、湿度及CO2浓度（5%），维持待测细胞的正常生长。

生物安全柜/超净工作台：提供无菌操作环境，用于细胞培养、传代、药物处理及染色过程中的无菌操作。

低速离心机：用于细胞收集、洗涤过程中的离心步骤，通常配备水平转子或角转子。

倒置显微镜：用于日常观察细胞的生长状态、密度以及消化程度，确保实验起始材料状态良好。

血球计数板或自动细胞计数仪：用于准确计数细胞，以便调整染色时的细胞浓度，保证结果可比性。

涡旋振荡器：用于短暂而温和地混匀细胞悬液，确保细胞和染料均匀分散，避免细胞成团。

4℃冰箱：用于储存Annexin V、PI试剂、结合缓冲液等关键试剂，保证试剂的稳定性。

制冰机：制备实验所需的冰块，用于配制预冷的PBS，以及染色过程中保持样本低温。

数据分析工作站：安装有流式细胞仪配套分析软件（如FlowJo、FCS Express等）的计算机，用于处理和分析原始数据。

检测流程

线上咨询或者拨打咨询电话;

获取样品信息和检测项目;

支付检测费用并签署委托书;

开展实验，获取相关数据资料;

出具检测报告。