棉花皱叶病毒诊断检测

检测项目

病毒粒子形态学鉴定、外壳蛋白电泳分析、双链RNA分离纯化、DNA探针杂交试验、实时荧光定量PCR（qPCR）、逆转录PCR（RT-PCR）、环介导等温扩增（LAMP）、酶联免疫吸附测定（ELISA）、免疫胶体金层析试纸法、WesternBlot验证、病毒基因组测序分析、寄主接种试验、血清学交叉反应测试、病毒浓度梯度稀释测定、引物特异性验证、内参基因稳定性评估、核酸提取效率测试、阳性对照品制备验证、阴性对照设置规范、样本保存稳定性研究、RNA完整性检测（RIN值）、DNA酶/RNA酶污染筛查、移液器校准验证实验、实验室环境气溶胶监控、数据重复性验证（CV值计算）、扩增曲线阈值设定优化、熔解曲线特异性分析、Ct值判读标准化流程

检测范围

棉花幼苗期真叶样本、成株期顶梢嫩叶样本、花蕾苞叶样本、棉铃表皮组织样本、茎秆维管束切片样本、根系分泌物样本感病植株邻近土壤样本（0-20cm层）、灌溉水样过滤浓缩物样本带毒烟粉虱成虫标本（Bemisiatabaci）、若虫口器提取物样本棉籽种皮研磨液样本病株汁液离心上清液样本温室栽培基质样本农具表面擦拭样本嫁接接穗/砧木界面组织样本转基因抗病材料筛选样本疑似病株相邻杂草标本（如苘麻属植物）实验室保存毒源冻干粉样本田间诱虫黄板粘着物样本无人机航拍疑似病区植株叶片标本超低温保存的病毒分离物样本病株细胞壁碎片样本叶脉透明化处理标本人工气候室培养的接种植株样本病健交界处组织切片样本棉田周边野生寄主植物标本

检测方法

透射电子显微镜法：通过负染色技术直接观察提纯病毒粒子形态特征及尺寸参数（直径18-22nm），需配合超速离心进行病毒富集。

双抗体夹心ELISA：采用CLCrV特异性单克隆抗体包被微孔板，可检出浓度≥1ng/mL的外壳蛋白溶液。

巢式PCR扩增：设计两对引物分步扩增病毒基因组DNA-A组分保守区段（AV1基因），灵敏度达10拷贝/μL。

宏基因组测序：对混合感染样本进行高通量测序后比对NCBI数据库中的Geminiviridae科参考序列。

分子信标探针法：在实时荧光定量PCR中使用TaqMan探针定量测定病毒载量动态变化。

免疫电镜技术：将特异性抗体与病毒粒子结合后观察抗原-抗体复合物结构特征。

dot-blot杂交法：将粗提核酸点样于尼龙膜后与地高辛标记探针进行杂交显色。

检测标准

GB/T36834-2018植物病毒核酸检测通用规范
SN/T2127-2015进出境棉花检疫规程
NY/T3179-2018农作物病害分子检测实验室建设规范
ISO16140-3:2021分子生物学方法验证通用要求
EPPOPM7/98(2)双生病毒科诊断协议
GB/T3543.5-1995农作物种子检验规程真实性鉴定
NY/T401-2000脱毒棉种生产技术规程
ASTME3069-19植物病原体实时PCR定量指南
ISO/IEC17025:2017检测实验室能力通用要求
GB19489-2008实验室生物安全通用要求

检测仪器

超速离心机：配置SW32Ti转子用于病毒粒子的蔗糖密度梯度离心纯化（100,000g）。

实时荧光定量PCR仪：支持TaqMan探针与SYBRGreen双通道检测模式。

全自动酶标仪：配备450nm/630nm双波长滤光片系统完成ELISA读数。

冷冻切片机：制备厚度5μm的植物组织切片用于原位杂交定位。

核酸蛋白测定仪：通过紫外吸收法快速测定DNA/RNA浓度及纯度（A260/A280比值）。

生物安全柜：ClassIIA2型保障BSL-2级病原体操作安全。

凝胶成像系统：配备EB染色观察模块和条带密度分析软件。

超低温冰箱：-80℃长期保存病毒分离物及阳性对照品。

检测流程

线上咨询或者拨打咨询电话;

获取样品信息和检测项目;

支付检测费用并签署委托书;

开展实验，获取相关数据资料;

出具检测报告。