肽图谱液相分析

检测项目

肽段分子量测定：通过高分辨率质谱精确测定酶解后各肽段的分子量，是构建肽图谱的基础。

氨基酸序列确认：利用串联质谱（MS/MS）对肽段进行碎裂，解析其氨基酸排列顺序，验证理论序列。

翻译后修饰鉴定：检测并定位蛋白质上的磷酸化、糖基化、氧化、脱酰胺等化学修饰。

二硫键定位分析：通过非还原酶解或特定化学处理，确定蛋白质中二硫键的连接位置。

N-端/C-端序列异质性分析：识别蛋白质末端的不均一性，如信号肽不完全切除或末端修饰。

肽段覆盖率计算：评估通过质谱检测到的肽段序列所覆盖的蛋白质全长序列的百分比。

突变与变异体鉴别：发现蛋白质序列中存在的点突变、插入、缺失或遗传变异。

氧化变体定量分析：对甲硫氨酸、色氨酸等易氧化氨基酸的氧化产物进行定性和相对定量。

糖型分析与糖基化位点鉴定：针对糖蛋白，分析连接在特定天冬酰胺上的寡糖链结构及位点占据率。

工艺相关杂质鉴定

检测范围

重组治疗性蛋白质药物：如单克隆抗体、融合蛋白、激素、细胞因子等的质控与放行。

生物类似药相似性评价：在结构、修饰和纯度层面，与参照药进行头对头的精细比对。

疫苗抗原表征：对疫苗中的关键蛋白抗原成分进行全面的结构确认和一致性评估。

基因治疗产品中的载体蛋白：分析病毒载体衣壳蛋白的完整性和修饰状态。

细胞培养过程监控：监测生产过程中蛋白质产物的关键质量属性变化，指导工艺优化。

蛋白质组学研究：用于复杂生物样品中蛋白质的鉴定、定量和修饰组学分析。

酶与酶抑制剂研究：解析酶的活性位点、与抑制剂的作用位点及构效关系。

诊断试剂核心蛋白原料：确保用于免疫检测的抗原/抗体试剂的批间一致性和稳定性。

食品与保健品中的活性蛋白：鉴定和评估功能性肽或蛋白质产品的成分与真实性。

法医与物种鉴定蛋白标志物：通过特征肽段分析，实现物种来源或个体身份的鉴别。

检测方法

胰蛋白酶酶解：最常用的方法，在精氨酸和赖氨酸位点切割，产生适合质谱分析的肽段。

Lys-C/Glu-C等特异性蛋白酶解：使用不同切割特异性的蛋白酶，提供互补的序列覆盖信息。

还原烷基化处理：使用二硫苏糖醇（DTT）或TCEP还原二硫键，并用碘乙酰胺（IAA）烷基化以防重新形成。

反相高效液相色谱分离：利用C18等色谱柱，根据肽段的疏水性差异进行高分辨率分离。

纳升液相色谱联用技术：使用极细内径的色谱柱和低流速，大幅提高质谱检测灵敏度和离子化效率。

电喷雾电离质谱：将液相流出的肽段在高压电场下雾化并离子化，是联用的主要离子源技术。

高分辨率串联质谱分析：采用飞行时间（TOF）、轨道阱（Orbitrap）等质量分析器进行精确质量数和MS/MS谱图采集。

数据依赖性采集模式：根据一级全扫描中信号强度，自动选择前体离子进行碎裂，是主流的数据采集策略。

数据库搜索与谱图匹配：将实验获得的MS/MS谱图与理论蛋白质序列数据库生成的谱图进行比对，实现肽段鉴定。

De Novo从头测序：在不依赖数据库的情况下，直接从MS/MS谱图推导肽段氨基酸序列，用于新蛋白或变异分析。

检测仪器设备

高效液相色谱仪：用于肽段混合物的在线分离，通常配备二元或四元梯度泵、自动进样器和柱温箱。

纳升液相色谱系统：专为蛋白质组学设计，采用超低流速和微流/纳流色谱柱，实现超高灵敏度分析。

C18反相色谱柱：最核心的分离介质，粒径通常为1.7-3μm，内径从75μm到2.1mm不等，用于肽段保留与洗脱。

高分辨率质谱仪：如Q-TOF、Orbitrap系列质谱仪，提供高质量精度和分辨率，用于精确分子量测定和定量。

三重四极杆质谱仪：在需要高灵敏度和高特异性的靶向定量分析（如多反应监测MRM）时使用。

电喷雾电离源：连接液相与质谱的关键接口，将液相中的肽段转化为气相离子。

紫外检测器或二极管阵列检测器：通常置于色谱柱后、质谱前，用于实时监测肽段在214nm等波长下的洗脱情况。

酶解与样品处理工作站：自动化液体处理平台，用于实现还原、烷基化、酶解等样品前处理步骤的标准化和高通量化。

离心浓缩仪或真空离心机：用于酶解前后样品的干燥、浓缩或溶剂置换。

数据分析工作站与专业软件：配备高性能计算机和专业软件（如ProteinPilot, MaxQuant, PEAKS等），用于原始数据处理、数据库搜索和结果报告生成。

检测流程

线上咨询或者拨打咨询电话;

获取样品信息和检测项目;

支付检测费用并签署委托书;

开展实验，获取相关数据资料;

出具检测报告。