相互作用蛋白pull-down检测

检测项目

诱饵蛋白与猎物蛋白的直接相互作用验证：确认目标蛋白（诱饵）是否能与疑似互作蛋白（猎物）在体外直接结合。

复合体形成能力分析：评估诱饵蛋白是否能够与多个猎物蛋白形成稳定的蛋白质复合物。

相互作用结构域/位点鉴定：通过截断体或点突变蛋白，确定介导相互作用的关键功能域或氨基酸残基。

抗体-抗原相互作用确认：验证特定抗体是否能特异性识别并下拉其靶抗原蛋白。

小分子与靶蛋白结合验证：将小分子固定在基质上，用于下拉并鉴定其细胞内结合蛋白。

新型相互作用蛋白的筛选与发现：以已知蛋白为诱饵，从细胞裂解液或蛋白文库中“钓取”未知的互作蛋白。

相互作用强度与亲和力比较：通过调整洗脱条件或进行竞争实验，半定量比较不同互作对的结合强弱。

翻译后修饰依赖的互作研究：探究磷酸化、泛素化等修饰是否影响特定蛋白质相互作用的发生。

重组蛋白相互作用验证：验证在大肠杆菌、昆虫细胞等系统中表达纯化的重组蛋白之间是否存在直接结合。

竞争性结合实验：研究第三种蛋白或化合物是否能竞争性抑制已知的两个蛋白之间的相互作用。

检测范围

细胞内源性互作验证：适用于验证在生理条件下细胞内天然存在的蛋白质相互作用。

体外重组蛋白互作分析：适用于研究在非细胞环境下，纯化的重组蛋白之间的直接结合。

原核生物蛋白互作研究：可用于细菌等原核生物系统中蛋白质相互作用网络的构建。

真核生物蛋白互作研究：广泛适用于酵母、植物、哺乳动物细胞等真核系统。

病毒-宿主蛋白互作鉴定：用于筛选和鉴定病毒蛋白与宿主细胞蛋白之间的相互作用，揭示感染机制。

信号通路节点互作图谱绘制：用于解析特定信号转导通路中上下游蛋白间的直接连接关系。

膜蛋白胞内域互作伙伴寻找：通过表达其胞内结构域作为诱饵，寻找与膜蛋白相关的细胞内信号分子。

核酸结合蛋白的共作用因子筛选：以转录因子等核酸结合蛋白为诱饵，寻找其调控功能所需的辅助蛋白。

酶与底物/调节因子互作研究：用于鉴定特定酶的底物、抑制剂或变构调节因子。

药物靶点蛋白的脱靶效应筛查：通过药物小分子Pull-down，系统性寻找其在细胞内的其他潜在结合蛋白，评估脱靶风险。

检测方法

GST Pull-down：将诱饵蛋白与谷胱甘肽S-转移酶融合表达，利用谷胱甘肽琼脂糖珠进行固定和下拉实验。

His Pull-down：将诱饵蛋白融合组氨酸标签，通过固定化金属离子亲和层析柱进行纯化和互作捕获。

MBP Pull-down：利用麦芽糖结合蛋白标签与交联淀粉树脂的结合特性进行下拉实验。

生物素-链霉亲和素Pull-down：将诱饵蛋白进行生物素化标记，利用链霉亲和素磁珠的高亲和力进行捕获，灵敏度高。

抗体介导的免疫共沉淀式Pull-down：将针对诱饵蛋白的特异性抗体固定在Protein A/G磁珠上，用于下拉互作蛋白。

直接偶联法Pull-down：将纯化的诱饵蛋白通过化学交联直接共价偶联到活化琼脂糖珠上。

溶液内Pull-down：在溶液中进行结合反应后，再添加捕获介质，可减少空间位阻，提高结合效率。

串联亲和纯化：使用两个不同的标签进行两步纯化，显著降低非特异性结合背景。

竞争性洗脱法：在洗脱步骤中加入游离的标签底物或竞争性多肽，用于验证相互作用的特异性。

下拉-质谱联用技术：将Pull-down技术与高通量质谱分析相结合，用于大规模互作蛋白质组的筛选与鉴定。

检测仪器设备

低温高速离心机：用于样品制备、沉淀 beads 以及分离细胞组分，保持蛋白质活性。

垂直混合仪/旋转摇床：用于孵育期间缓慢混合样品，确保诱饵与猎物或 beads 充分接触。

磁力分离架：当使用磁珠时，用于快速、无损地分离 beads 与溶液相。

蛋白质电泳系统：包括电泳仪和电泳槽，用于对下拉产物进行SDS-PAGE分离。

半干/湿式转印仪：将凝胶中的蛋白质转移至PVDF或NC膜上，用于后续免疫检测。

化学发光成像系统：用于检测和采集 Western Blot 实验中化学发光信号，对结果进行成像和分析。

酶标仪：可用于定量分析蛋白质浓度或进行基于ELISA原理的 Pull-down 结果快速检测。

超声波细胞破碎仪：用于高效裂解细胞，释放细胞内蛋白质，同时可剪切基因组DNA降低粘度。

恒温培养箱/摇床：用于重组蛋白的诱导表达以及细菌、酵母等培养物的培养。

-80°C超低温冰箱及4°C冷柜：用于长期保存样品、试剂以及短期存放实验过程中的对温度敏感的组分。

检测流程

线上咨询或者拨打咨询电话;

获取样品信息和检测项目;

支付检测费用并签署委托书;

开展实验，获取相关数据资料;

出具检测报告。