肽图谱分析实验

检测项目

蛋白质一级结构确认：通过分析酶解肽段的序列，确认目标蛋白质的氨基酸排列顺序是否正确。

二硫键定位与配对分析：确定蛋白质分子内或分子间二硫键的连接位置和配对方式，对高级结构至关重要。

翻译后修饰鉴定：检测并定位如磷酸化、糖基化、乙酰化等常见的翻译后修饰位点。

序列变异体分析：识别因点突变、截短或延长等原因产生的氨基酸序列变异。

N-端和C-端序列验证：确认蛋白质的起始和末端氨基酸序列，判断加工是否完全。

氧化修饰分析：检测甲硫氨酸、色氨酸等氨基酸的氧化状态，评估蛋白质稳定性。

脱酰胺化分析：定位天冬酰胺或谷氨酰胺的脱酰胺化位点，这是蛋白质降解的常见途径。

糖型分析与糖基化位点鉴定：对于糖蛋白，分析其糖链组成、结构以及连接的肽段位点。

肽段覆盖率计算：通过已鉴定到的肽段序列计算其对完整蛋白质序列的覆盖比例，评估分析完整性。

杂质与降解产物鉴定：识别样品中可能存在的工艺相关杂质（如宿主细胞蛋白）或降解产生的肽段。

检测范围

重组治疗性蛋白药物：如单克隆抗体、融合蛋白、激素等，是生物药质量控制的必检项目。

疫苗抗原：用于表征疫苗中关键蛋白组分的结构一致性与完整性。

基因工程产物：各类通过基因工程技术表达的蛋白质或多肽产品。

血浆蛋白制品：如白蛋白、凝血因子等，需要严格的结构确证。

酶制剂：工业或诊断用酶，其活性中心与结构密切相关。

细胞培养上清与裂解液：用于上游工艺开发中目标蛋白的表达与修饰监测。

纯化中间体与终产品：在纯化工艺的各个阶段监控蛋白质的结构稳定性。

生物类似药：与原研药进行头对头的肽图谱比对，以证明结构相似性。

蛋白质组学研究样本：从复杂生物样本（如组织、细胞）中提取的蛋白质混合物。

稳定性研究样品：在加速或长期稳定性条件下放置的样品，用于评估降解途径。

检测方法

酶解法：使用胰蛋白酶、Lys-C等特异性蛋白酶将蛋白质切割成特征肽段混合物。

还原烷基化处理：使用DTT或TCEP还原二硫键，并用碘乙酰胺等烷基化试剂封闭巯基。

高效液相色谱分离：通常使用反相色谱柱在纳流或微流系统上分离复杂的肽段混合物。

质谱分析：核心检测手段，包括电喷雾电离和基质辅助激光解吸电离两种主要离子化方式。

串联质谱：对母离子进行碰撞诱导解离，产生碎片离子谱图用于肽段序列解析。

肽质量指纹图谱：通过测量酶解后全部肽段的精确质量，与理论数据库比对进行鉴定。

液相色谱-串联质谱联用：将液相色谱的分离能力与质谱的鉴定能力结合，是主流技术平台。

数据库搜索：将实验获得的质谱数据与理论蛋白质序列数据库进行比对，完成鉴定。

图谱比对分析：将不同批次或不同条件下的肽图谱进行叠加比对，直观观察差异。

定量肽图谱：结合稳定同位素标记或非标记定量技术，对不同样品中特定肽段的丰度进行相对或绝对定量。

检测仪器设备

高效液相色谱仪：用于肽段混合物的分离，常配备微径或纳径反相色谱柱。

三重四极杆质谱仪：适用于目标肽段的定量分析，具有高灵敏度和特异性。

飞行时间质谱仪：提供高分辨率和高质量精度，常用于肽质量指纹图谱分析。

轨道阱傅里叶变换质谱仪：目前主流的高分辨质谱仪，具有极高的分辨率、质量精度和扫描速度。

离子阱质谱仪：可进行多级串联质谱分析，有利于肽段序列的从头解析和修饰鉴定。

纳升电喷雾离子源：与液相色谱联用，实现低流速下的高效离子化，提升灵敏度。

基质辅助激光解吸电离源：常用于离线分析，特别适合与TOF-MS联用进行PMF分析。

酶解工作站或恒温仪：为蛋白质酶解过程提供精确的温度和时间控制。

高速离心机与真空离心浓缩仪：用于样品处理过程中的脱盐、浓缩和干燥步骤。

数据处理工作站与专业软件：配备高性能计算机和专业软件用于质谱数据的采集、处理、数据库搜索和结果分析。

检测流程

线上咨询或者拨打咨询电话;

获取样品信息和检测项目;

支付检测费用并签署委托书;

开展实验，获取相关数据资料;

出具检测报告。