酶蛋白免疫印迹检测

检测项目

目标蛋白定性分析：确认样品中是否存在特定的目标酶蛋白，是免疫印迹最基础的应用。

蛋白分子量测定：通过与已知分子量的标准品对比，估算目标蛋白的表观分子量。

蛋白表达水平半定量：通过检测信号强度，比较不同样品间同一蛋白的相对表达量差异。

蛋白翻译后修饰检测：如磷酸化、糖基化、乙酰化等，需使用识别特定修饰位点的抗体。

蛋白异构体鉴定：区分由于剪接或修饰不同而产生的、分子量相近的蛋白异构体。

抗体特异性验证：验证新制备或购买的抗体是否能特异性地识别目标抗原。

蛋白相互作用初步验证：如免疫共沉淀后的产物，可通过免疫印迹验证相互作用蛋白。

疾病生物标志物筛查：在临床研究或诊断中，检测与疾病相关的特定蛋白标志物。

药物作用机制研究：观察药物处理后，目标信号通路关键蛋白表达或磷酸化水平的变化。

重组蛋白表达鉴定：在基因工程中，鉴定宿主细胞是否成功表达外源重组目标蛋白。

检测范围

细胞裂解液：来自培养的动物、植物或微生物细胞的整体蛋白提取物，是最常见的检测样本。

组织分浆液：从动物或植物组织中提取的蛋白质混合物，用于研究组织特异性表达。

血清或血浆样本：用于检测可溶性分泌蛋白、自身抗体或疾病相关的循环蛋白标志物。

细胞器分离组分：如细胞核、线粒体、胞浆等分离组分的蛋白，用于蛋白亚细胞定位研究。

免疫沉淀产物：经过抗体富集后的蛋白复合物，用于分析特定蛋白的互作伙伴。

重组蛋白纯化样品：经过纯化的重组蛋白，用于验证其纯度、完整性及免疫反应性。

植物提取蛋白：适用于农业和植物生物学研究，检测植物体内的特定酶或功能蛋白。

细菌或酵母裂解物：用于原核或真核微生物的基因表达分析与蛋白质功能研究。

脑脊液或其他体液：在神经科学或临床诊断中，检测其中低丰度的特异性蛋白。

蛋白质电泳分离后胶条：来自双向电泳的胶点，可切下后进行免疫鉴定以确认蛋白质身份。

检测方法

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：第一步，在变性条件下根据分子量大小分离蛋白质。

蛋白质转膜：将凝胶中分离的蛋白质转移到固相支持膜（如PVDF或NC膜）上。

膜封闭：使用脱脂牛奶或BSA溶液封闭膜上的非特异性结合位点，减少背景信号。

一抗孵育：用针对目标蛋白的特异性一抗与膜上的靶蛋白进行特异性结合。

洗涤步骤：使用缓冲液洗去未结合及非特异性结合的一抗，降低背景干扰。

二抗孵育：使用连接有报告酶（如HRP）的二抗，与一抗的Fc段结合进行信号放大。

化学发光法检测：最常用方法，通过HRP催化底物产生化学发光信号，由X光片或成像系统捕获。

显色法检测：使用HRP或AP催化底物产生不溶性有色沉淀，直接在膜上显色观察。

荧光法检测：使用连接荧光基团的二抗，通过荧光扫描仪成像，可实现多重检测。

图像分析与定量：使用专业软件对捕获的图像进行条带识别、背景扣除和灰度值定量分析。

检测仪器设备

垂直电泳槽：用于进行SDS-PAGE，核心部件包括玻璃板、制胶架和电泳内槽。

电源供应器：为电泳和转膜过程提供稳定或可编程的电压、电流和功率。

半干式或湿式转印系统：将蛋白质从凝胶电转移到固相膜上的关键设备。

摇床：用于转膜后膜的封闭、抗体孵育及洗涤过程，确保溶液均匀接触膜面。

化学发光成像系统：核心检测设备，包含高灵敏度CCD相机和暗箱，用于捕获化学发光信号。

荧光扫描成像仪：用于检测荧光标记的二抗信号，具有多通道检测能力。

凝胶成像分析系统：配备白光光源，可用于拍摄染色凝胶或显色法印迹膜图像。

图像分析软件：如ImageJ、Quantity One等，用于条带定量和数据分析的专业软件。

微量移液器及枪头：用于精确量取样品、抗体、缓冲液等各种试剂。

-20℃/-80℃冰箱及4℃冷柜：用于长期保存抗体、样品以及短期保存孵育中的膜和试剂。

检测流程

线上咨询或者拨打咨询电话;

获取样品信息和检测项目;

支付检测费用并签署委托书;

开展实验，获取相关数据资料;

出具检测报告。