间隙连接蛋白二聚化程度非还原电泳分析

检测项目

Cx43同源二聚体检测：特异性检测由两个相同Cx43亚基通过非共价相互作用形成的复合物。

Cx43异源二聚体检测：分析与不同亚型（如Cx43与Cx45）间隙连接蛋白形成的异源二聚复合物。

二聚体分子量确定：通过与标准蛋白Marker对比，估算二聚体复合物的近似分子量。

二聚化效率评估：通过光密度扫描，定量分析样品中二聚体形式占总蛋白的比例。

翻译后修饰影响：检测磷酸化、泛素化等修饰对间隙连接蛋白二聚化过程的影响。

药物或抑制剂干预效果：评估特定化合物对间隙连接蛋白二聚化程度的促进或抑制作用。

疾病模型状态分析：比较病理条件（如心肌缺血、肿瘤）下与正常组织中蛋白二聚化水平的差异。

突变体二聚化能力：研究特定位点突变是否破坏或增强间隙连接蛋白的二聚化功能。

亚细胞定位相关性：结合细胞分级分离，分析不同细胞组分中二聚体的分布情况。

时间进程动力学研究：在特定刺激后不同时间点取样，追踪二聚体形成的动态过程。

检测范围

连接蛋白家族成员：适用于Cx43、Cx32、Cx26、Cx45等多种间隙连接蛋白亚型。

细胞裂解液样本：主要应用于从培养细胞或组织中提取的总蛋白裂解液。

膜蛋白富集组分：特别适用于经过膜蛋白提取或富集处理的样品，以提高检测灵敏度。

体外翻译产物：可用于检测在无细胞系统中表达的放射性或标签标记的间隙连接蛋白。

免疫共沉淀洗脱液：对通过免疫共沉淀初步纯化的蛋白复合物进行进一步的二聚化分析。

不同物种来源样本：适用于人、大鼠、小鼠等多种哺乳动物来源的间隙连接蛋白研究。

稳定转染细胞系：分析过表达野生型或突变型间隙连接蛋白的细胞系中蛋白的组装状态。

原代培养细胞：如心肌细胞、星形胶质细胞等具有丰富间隙连接的原代细胞。

组织匀浆液：可直接对心脏、肝脏、脑等实体组织匀浆后的蛋白进行检测。

重组蛋白样品：对纯化的重组间隙连接蛋白进行体外二聚化条件的摸索与验证。

检测方法

非还原性样品制备：在裂解液和上样缓冲液中严格避免使用β-巯基乙醇或DTT等还原剂。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：采用标准SDS-PAGE分离蛋白质，但保持样品非还原状态。

梯度凝胶电泳：使用4%-20%等梯度胶以提高对不同分子量二聚体的分离分辨率。

Western Blot免疫印迹：电泳后将蛋白转印至PVDF或NC膜，进行特异性免疫检测。

化学交联辅助检测

双色荧光标记共定位分析：对两种不同标签的蛋白共转染后，通过非还原电泳与荧光检测分析共迁移条带。

对照实验设置：必须设置还原处理（加DTT）的对照样品，以确认非还原条件下条带为二硫键依赖或非依赖的二聚体。

光密度定量分析：使用图像分析软件对二聚体和单体条带进行灰度值扫描和定量比较。

质谱鉴定验证：将非还原电泳胶上的疑似二聚体条带切下，进行还原烷基化处理后，用质谱鉴定其组成。

检测仪器设备

垂直板电泳槽：用于进行SDS-PAGE的核心装置，需兼容不同厚度的凝胶板。

高精度稳压稳流电泳仪：为SDS-PAGE提供稳定、可调的电压和电流。

半干式或湿式转印系统：用于将凝胶中的蛋白质转移至固相膜上，以进行后续免疫检测。

化学发光成像系统：高灵敏度CCD相机成像仪，用于捕获Western Blot的化学发光信号。

凝胶成像分析系统：配备白光板的成像系统，用于考马斯亮蓝染色胶或荧光标记胶的图像采集与分析。

低温高速离心机：用于细胞和组织样品的快速低温离心，制备高质量蛋白裂解液。

超声波细胞破碎仪

多功能酶标仪

精密电子天平

检测流程

线上咨询或者拨打咨询电话;

获取样品信息和检测项目;

支付检测费用并签署委托书;

开展实验，获取相关数据资料;

出具检测报告。