蛋白印迹试验

检测项目

目标蛋白定性分析：确认样品中是否存在特定的目标蛋白质，是试验最基本的功能。

目标蛋白定量分析：通过灰度分析等手段，比较不同样品间目标蛋白的相对表达量。

蛋白质分子量测定：通过与已知分子量的标准品对比，估算目标蛋白的表观分子量。

蛋白质翻译后修饰检测：如磷酸化、乙酰化、泛素化等，需使用特异性修饰抗体进行检测。

蛋白质二聚体或多聚体分析：观察在非还原条件下蛋白质是否形成高级结构。

抗体特异性验证：验证新制备或购买的抗体是否能特异性识别目标蛋白。

信号通路蛋白激活状态：检测信号通路中关键蛋白（如激酶）的磷酸化激活状态。

蛋白表达谱分析：通过检测多个蛋白，分析其在特定生理或病理条件下的表达变化。

蛋白相互作用间接证据：若互作蛋白影响目标蛋白的稳定性或修饰，可在印迹上体现。

疾病生物标志物筛选：在临床样本中筛选与疾病发生发展相关的差异表达蛋白。

检测范围

细胞裂解液：来自各种培养细胞系的整体蛋白提取物，是最常见的检测样本。

组织分浆液：来自动物或人体组织的蛋白提取物，用于在体研究蛋白表达。

血清或血浆样本：用于检测体液中的可溶性蛋白、自身抗体或疾病标志物。

细菌或酵母裂解物：用于原核或真核表达系统的蛋白表达鉴定与纯化分析。

植物蛋白提取物：应用于植物生物学研究，分析植物特定蛋白的表达与功能。

重组蛋白样品：验证重组蛋白的表达、纯化效果及鉴定其免疫反应性。

亚细胞组分：如细胞核、线粒体、细胞膜等分离组分的蛋白，进行定位研究。

免疫沉淀产物：将免疫沉淀后的样品进行印迹，验证互作或检测特定复合物。

脑脊液或其他体液：用于神经性疾病或特定器官疾病的相关蛋白标志物研究。

病毒或病原体蛋白：检测病原体感染宿主后，其自身蛋白或宿主应答蛋白的表达。

检测方法

样品制备与蛋白定量：裂解细胞或组织，使用BCA或Bradford法精确测定蛋白浓度。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：根据分子量大小，在变性条件下将蛋白质混合物分离。

蛋白质转膜：将凝胶中分离的蛋白电转移至固相支持物（如PVDF膜或NC膜）上。

膜封闭：使用脱脂牛奶或BSA溶液封闭膜上的非特异性结合位点，减少背景。

一抗孵育：使用针对目标蛋白的特异性一抗与膜上的蛋白进行特异性结合。

洗涤：用含有吐温的缓冲液洗去未结合的一抗，降低非特异性信号。

二抗孵育：孵育带有酶或荧光标记的二抗，二抗能特异性识别并结合一抗。

再次洗涤：彻底洗去未结合的二抗，为显影或成像做准备。

信号检测：根据二抗标记物（如HRP、AP或荧光染料），采用化学发光、显色底物或荧光扫描进行检测。

结果分析与内参校正：使用图像分析软件对条带进行定量，并用内参蛋白（如β-actin、GAPDH）校正上样量差异。

检测仪器设备

垂直电泳槽：用于进行SDS-PAGE，配备玻璃板、梳子等，实现蛋白的凝胶电泳分离。

电转仪：提供稳定电场，将凝胶中的蛋白质高效、均匀地转移至印迹膜上。

稳压稳流电泳仪电源：为电泳和转膜过程提供可调节的稳定电压或电流。

摇床：用于孵育抗体和洗涤膜时提供温和的振荡，确保反应均匀充分。

化学发光成像系统：核心检测设备，用于捕获和记录化学发光反应产生的信号。

荧光成像系统：当使用荧光标记二抗时，用于激发并检测荧光信号，灵敏度高且线性范围宽。

凝胶成像分析系统：配备特定光源和滤镜，可用于染色凝胶或显色法印迹膜的成像与分析。

微量分光光度计/酶标仪：用于快速、准确地测定蛋白样品浓度。

制冰机：提供实验过程中所需的冰块，用于保持样品和试剂的低温环境，防止蛋白降解。

分析软件：如Image J、Quantity One等，用于对获得的蛋白条带图像进行灰度分析和定量处理。

检测流程

线上咨询或者拨打咨询电话;

获取样品信息和检测项目;

支付检测费用并签署委托书;

开展实验，获取相关数据资料;

出具检测报告。