核酸污染紫外吸收比值测试

检测项目

A260/A280比值：评估核酸样品中蛋白质污染程度的关键指标，纯DNA和RNA的理想比值分别约为1.8和2.0。

A260/A230比值：反映样品中盐类、胍盐、酚或碳水化合物等小分子污染物的水平，理想值通常应大于2.0。

A260吸光度值：直接用于定量核酸浓度，基于核酸在260 nm波长处有最大吸收峰的原理。

A280吸光度值：主要反映蛋白质的吸光度，因为蛋白质中的芳香族氨基酸在280 nm处有吸收。

A230吸光度值：检测碳水化合物、某些盐离子和有机化合物污染的敏感指标。

A320吸光度值：测量溶液的浊度或光散射背景，用于校正其他波长的吸光度值。

核酸浓度计算：根据A260吸光度和比消光系数（如50 μg/mL for DNA）精确计算样品中核酸的浓度。

蛋白质污染评估：通过A260/A280比值的偏离程度，定性及半定量判断蛋白质污染的存在与严重性。

盐类污染评估：通过A260/A230比值的降低，指示样品中可能存在硫氰酸胍、盐酸胍或氯化钠等残留。

酚类污染评估：异常的A230或A270吸光度可能提示苯酚或异硫氰酸苯酯等有机溶剂的残留。

检测范围

基因组DNA提取物：从动植物组织、血液、细胞或微生物中提取的基因组DNA的纯度与浓度检测。

质粒DNA样品：对大肠杆菌中提取的质粒DNA进行纯度分析，确保转染或测序等实验的可靠性。

PCR产物纯化后：对PCR扩增后的纯化产物进行检测，验证引物二聚体、dNTPs及酶等是否去除干净。

总RNA提取物：评估RNA样品的完整性（需结合电泳）和纯度，特别是蛋白质及基因组DNA污染。

mRNA纯化样品：对经过oligo(dT)纯化的mRNA进行质控，确保其适用于 cDNA 合成或建库。

体外转录产物：检测合成的RNA产物纯度，评估模板DNA、NTPs及酶等成分的残留情况。

核酸标准品与对照：对商业或自制的核酸标准品、阳性对照进行定值与纯度验证。

酶切与连接产物：在分子克隆步骤中，对酶切或连接后的核酸样品进行快速纯度筛查。

核酸杂交探针：评估标记（如地高辛、生物素）后的核酸探针的浓度与潜在干扰物。

测序文库样品：在建库流程的关键节点，对片段化、末端修复、加A、连接接头后的文库进行质控。

检测方法

样品适当稀释：使用TE缓冲液或超纯水将样品稀释至仪器线性检测范围内（通常A260在0.1-1.0之间）。

空白校正：使用与溶解/稀释样品相同的缓冲液作为空白对照，进行仪器归零操作。

紫外全波长扫描：在220 nm至350 nm波长范围内进行扫描，观察吸收曲线形态以获取全面信息。

定点波长测量：分别精确测量样品在230 nm、260 nm、280 nm及320 nm处的吸光度值。

背景扣除：使用A320（或A340）的吸光度值作为背景，从A230、A260、A280的测量值中扣除。

比值计算：根据公式计算A260/A280和A260/A230的比值，并记录原始吸光度和校正后吸光度。

浓度计算：应用公式“浓度 (μg/mL) = A260 × 稀释倍数 × 换算系数（DNA通常为50，RNA为40）”进行计算。

结果判读与记录：将计算出的比值和浓度与标准范围比较，判断纯度，并完整记录所有数据。

比色皿清洁：测量前后使用专用清洗液和超纯水彻底清洗石英比色皿，避免交叉污染。

质量控制：定期使用已知浓度和比值的标准品（如NIST traceable标准）对仪器和流程进行校准验证。

检测仪器设备

紫外-可见分光光度计：核心设备，能够提供特定波长或全波长的吸光度测量功能。

微量石英比色皿：用于盛放微量样品（通常为50-100 μL），要求光程准确、透光性好、无荧光。

超微量分光光度计：适用于极微量样品（0.5-2 μL）的检测，无需比色皿，使用加样平台。

核酸蛋白定量仪：专门为核酸和蛋白定量设计的仪器，通常内置多种计算程序和比值分析功能。

移液器及专用吸头：高精度移液器（如0.5-10 μL，10-100 μL）及无核酸酶吸头，用于精确取样和稀释。

涡旋振荡器：用于充分混匀样品与稀释液，确保测量样品的均匀性和代表性。

微型离心机：用于快速离心收集管壁或盖上的液滴，防止加样时产生气泡影响光路。

超纯水系统：提供电阻率18.2 MΩ·cm的超纯水，用于稀释样品、清洗器皿及作为空白对照。

TE缓冲液或无菌水：常用的核酸稀释液，TE缓冲液中的EDTA能螯合金属离子，稳定核酸。

无尘纸或镜头纸：用于轻柔擦拭石英比色皿的光学面，去除指纹和水渍，保证透光率。

检测流程

线上咨询或者拨打咨询电话;

获取样品信息和检测项目;

支付检测费用并签署委托书;

开展实验，获取相关数据资料;

出具检测报告。