疏水作用色谱分析

检测项目

蛋白质纯度分析：评估目标蛋白质样品中是否含有其他蛋白质杂质，是下游应用前的关键质控步骤。

蛋白质聚集体检测：识别和定量样品中的二聚体、多聚体等高分子量聚集物，对药物稳定性至关重要。

单克隆抗体电荷变体分析：分离因脱酰胺、氧化等修饰导致疏水性变化的抗体电荷异构体。

重组蛋白疏水性表征：通过保留时间分析蛋白质表面的整体疏水性强弱，用于突变体筛选或工艺比较。

膜蛋白提取物分析：利用其疏水特性，分离和初步分析难溶的膜蛋白或膜蛋白复合物。

酶与抑制剂复合物研究：分析结合前后疏水性的变化，用于研究相互作用或筛选先导化合物。

肽图分析：用于分离酶解后产生的疏水性不同的肽段，辅助蛋白质鉴定或翻译后修饰分析。

病毒样颗粒纯度检测：基于表面疏水性差异，分离VLP与宿主细胞蛋白等杂质。

融合蛋白稳定性评估：监测在不同压力条件下（如温度、pH）融合蛋白疏水性的变化，预测其稳定性。

生物类似药相似性比对：对比原研药与类似药在HIC色谱图上的峰形与保留行为，是关键的理化比对项目。

检测范围

单克隆抗体与抗体偶联药物：是HIC最主要的应用领域，用于分析电荷变体、聚集体、片段及ADC的载药分布。

其他治疗性重组蛋白：如细胞因子、生长因子、激素、融合蛋白、酶类药物等的纯度和变体分析。

疫苗产品：包括基于蛋白质的亚单位疫苗、病毒样颗粒疫苗的纯化与表征。

血浆蛋白制品：如凝血因子、免疫球蛋白、白蛋白等血液制品的分离与杂质检测。

细胞培养上清液：直接或初步纯化后分析，用于上游工艺开发与产物表达监测。

蛋白纯化中间品：在纯化工艺的多个步骤中取样，评估每一步的纯化效果和疏水性杂质去除情况。

诊断用酶与抗原：确保诊断试剂核心蛋白原料的均一性和活性。

工业用酶制剂：评估酶制剂的纯度、稳定性以及不同批次间的一致性。

多肽类药物：分离和分析具有不同疏水性的合成或天然多肽。

核酸适配体与疏水性修饰核酸：用于分析经过烷基链等疏水修饰的核酸分子。

检测方法

线性梯度洗脱法：最常用方法，通过线性降低流动相盐浓度，使不同疏水性组分依次洗脱，实现高分辨率分离。

阶梯梯度洗脱法：采用盐浓度突降的阶梯式洗脱，适用于快速筛选或制备型分离。

等度洗脱法：在恒定盐浓度下洗脱，主要用于分析疏水性非常接近或特定的样品，方法开发相对复杂。

结合pH梯度洗脱法：通过改变pH值影响蛋白质表面电荷和疏水斑块，与盐梯度协同，优化选择性。

添加有机改性剂法：在流动相中添加低浓度的丙二醇、乙醇等，微调洗脱强度，改善峰形和分离度。

柱上聚焦法：使用高盐样品上样，使目标蛋白在柱头浓缩，提高检测灵敏度和分辨率。

多维色谱联用法：将HIC与IEX、SEC或RPLC在线联用，实现对复杂生物样品更全面的表征。

保留时间建模法：通过一系列标准蛋白或实验，建立保留时间与疏水性参数的关系模型，用于预测。

工艺相关杂质检测方法：针对宿主细胞蛋白、Protein A残留等特定杂质，开发具有专属性的HIC检测条件。

稳定性指示方法：开发能够有效分离目标蛋白与其降解产物（如氧化、脱酰胺变体）的HIC方法。

检测仪器设备

高效液相色谱系统：具备二元或四元梯度泵、自动进样器、柱温箱和紫外检测器的标准HPLC系统是基础。

疏水作用色谱柱：核心部件，填充有键合了苯基、丁基、辛基、醚基等弱疏水基团的硅胶或聚合物微球。

紫外-可见光检测器：最常用的在线检测器，通常检测280 nm（蛋白质）或260 nm（核酸）处的吸光度。

荧光检测器：提供更高的选择性和灵敏度，适用于痕量分析或具有内源荧光的样品。

多角度光散射检测器：与HIC联用，在线测定洗脱组分的绝对分子量和聚集状态。

质谱检测器：与HIC联用（通常需脱盐接口），用于洗脱峰的精确分子量测定和结构鉴定。

电导检测器：用于实时监测流动相的盐浓度变化，确保梯度重现性。

自动馏分收集器：在制备型或半制备型HIC中，用于自动收集纯化的目标组分。

色谱数据系统：用于仪器控制、方法运行、数据采集、处理和报告生成。

样品处理设备：包括离心机、滤膜、脱盐柱或透析装置，用于样品上样前的高盐缓冲液置换或澄清处理。

检测流程

线上咨询或者拨打咨询电话;

获取样品信息和检测项目;

支付检测费用并签署委托书;

开展实验，获取相关数据资料;

出具检测报告。