细菌固氮酶活性检测

检测项目

乙炔还原活性（ARA）：通过固氮酶催化乙炔还原为乙烯的速率反映活性，检测范围0.1~1000nmol C2H4/(g·h)，最低检测限0.05nmol C2H4，反应体系乙炔浓度10%（v/v），孵育温度28±1℃。

总固氮量（凯氏定氮法）：测定样品中所有含氮化合物的总量以反映固氮能力，检测范围0.01~100g N/kg，测试精度±0.5%，样品消解时间30~60min。

氨释放量（比色法）：通过奈氏试剂或吲哚酚蓝法检测酶促反应中氨的生成量，检测范围0.05~50mg NH3-N/L，最低检测限0.01mg NH3-N/L，显色时间10~20min。

固氮酶蛋白含量（Western blot）：利用特异性抗体检测固氮酶钼铁蛋白（MoFe蛋白）或铁蛋白（Fe蛋白）的含量，检测范围1~1000ng/mL，分辨率≥10ng，电泳凝胶浓度10%~15%。

酶促反应动力学参数：测定米氏常数（Km）及最大反应速率（Vmax），反映固氮酶对底物（如乙炔、N2）的亲和力及催化效率，Km范围0.1~10mmol/L，Vmax范围1~100μmol/(L·min)。

固氮基因（nifH）表达量（qPCR）：通过实时荧光定量PCR检测固氮酶结构基因nifH的mRNA水平，相对定量范围10~106 copies/μg RNA，扩增效率90%~110%，R2≥0.99。

厌氧条件下活性保持率：测定样品在厌氧环境（O2浓度≤10ppm）中放置24h后的活性残留率，检测范围0~100%，误差±5%。

底物亲和力测定：通过改变底物（如乙炔）浓度，绘制反应速率-底物浓度曲线，计算固氮酶对底物的亲和力常数，底物浓度范围0.01~10mmol/L，重复测定3次取平均值。

产物积累速率（乙烯生成速率）：连续监测乙炔还原反应中乙烯的生成速率，反映固氮酶活性的动态变化，监测时间0~24h，数据采集间隔1~60min，速率范围0.01~10nmol C2H4/min。

固氮酶钼铁蛋白含量（分光光度法）：利用钼铁蛋白的特征吸收光谱（如450nm处的吸收峰）定量，检测范围0.05~10mg/mL，摩尔消光系数ε450=1.2×104 L/(mol·cm)。

检测范围

农业微生物：包括根瘤菌（大豆根瘤菌、花生根瘤菌）、固氮菌肥中的功能菌株（如圆褐固氮菌、Azospirillum），用于评估其固氮效率及肥效。

土壤微生物：自生固氮菌（如巴斯德固氮菌）、联合固氮菌（如与玉米共生的固氮菌），来自农田、草原、森林等土壤样品，反映土壤固氮潜力。

水生微生物：蓝藻（如念珠藻、鱼腥藻）、水生固氮细菌（如湖底沉积物中的固氮菌），用于淡水或海水生态系统的固氮能力监测。

工业微生物：发酵罐中的基因工程固氮菌株（如重组大肠杆菌、枯草芽孢杆菌），评估工业生产中的固氮效率及稳定性。

植物内生菌：水稻内生固氮菌（如伯克霍尔德菌）、甘蔗内生菌（如Gluconacetobacter diazotrophicus），研究植物-微生物共生固氮机制。

环境监测样品：湖泊沉积物、河流底泥、城市污水处理厂活性污泥，检测其中固氮微生物的活性及群落结构。

生物肥料：复合固氮菌肥（含固氮菌、解磷菌）、微生物有机肥（添加固氮菌株），验证产品中固氮酶活性是否符合标准要求。

基因工程菌株：携带nif基因的转基因微生物（如转基因拟南芥内生菌），评估基因改造对固氮活性的影响。

生态研究样品：极地土壤微生物（如南极固氮菌）、沙漠微生物（如耐旱固氮菌），研究极端环境下的固氮适应机制。

饲料微生物：青贮饲料中的固氮菌（如乳酸杆菌属中的固氮菌株），评估饲料中微生物固氮对饲料营养价值的贡献。

检测标准

ISO 15685:2004 土壤质量 固氮菌活性的测定 乙炔还原法

GB/T 32723-2016 微生物肥料 固氮菌活性测定方法

ASTM D7582-15 水中固氮微生物活性测定 乙炔还原法

ISO 14240-2:2011 土壤微生物学 固氮作用的测定 第2部分：凯氏定氮法

NY/T 2066-2011 微生物肥料 固氮菌剂

GB/T 19524.1-2004 肥料中微生物的测定 第1部分：总则

ISO 20391-1:2018 食品链中的微生物 固氮菌的检测 第1部分：通用方法

GB/T 22503-2008 土壤微生物生物量氮的测定 氯仿熏蒸提取法

ASTM E2586-07 生物固体中固氮酶活性测定 乙炔还原法

ISO 11266:2005 土壤质量 微生物生物量的测定 熏蒸提取法

检测仪器

气相色谱仪：用于乙炔还原反应中乙烯产物的分离与定量，配置火焰离子化检测器（FID），检测限≤0.01ppm，线性范围10-9~10-3 g/mL，柱温箱温度范围40~300℃。

分光光度计：用于比色法测定氨释放量、固氮酶蛋白含量或钼铁蛋白含量，波长范围200~1000nm，吸光度精度±0.001A，带宽≤2nm。

实时荧光定量PCR仪（qPCR）：用于固氮基因（nifH）表达量的定量检测，支持SYBR Green或TaqMan探针法，检测灵敏度≤10 copies/反应，扩增效率90%~110%。

凯氏定氮仪：用于总固氮量的测定，包括消解、蒸馏、滴定三个步骤，样品处理量1~5g/次，蒸馏时间5~10min/样品，氮回收率≥98%。

厌氧培养箱：提供厌氧环境以维持固氮酶活性，控制氧气浓度≤10ppm，温度范围10~40℃，湿度范围50%~90%，用于样品预处理及反应体系构建。

高效液相色谱仪（HPLC）：用于分离酶促反应中的有机产物（如氨衍生物），配置紫外检测器（UV）或荧光检测器（FLD），检测限≤0.1μg/mL，柱压范围0~1000bar。

Western blot系统：包括电泳仪、转膜仪、化学发光成像系统，用于固氮酶蛋白的分离与检测，电泳电压100~200V，转膜电流0.2~0.8A，成像分辨率≥500dpi。

气体流量计：用于控制反应体系中乙炔、氮气等气体的流量，量程0~1000mL/min，精度±2%，支持数字显示及流量调节。

恒温摇床：保持酶促反应的温度恒定，温度范围4~60℃，振荡频率0~300rpm，振幅20~50mm，用于样品孵育及反应过程。

电子天平：用于称量样品或试剂，可读性0.1mg，最大称量范围0~200g，重复性误差≤0.2mg，确保样品量的准确性。

检测流程

线上咨询或者拨打咨询电话;

获取样品信息和检测项目;

支付检测费用并签署委托书;

开展实验，获取相关数据资料;

出具检测报告。