自噬流 LC3 免疫印迹分析

检测项目

LC3-I与LC3-II的检测：核心检测项目，通过区分LC3的胞质形式（LC3-I）和磷脂酰乙醇胺偶联的膜结合形式（LC3-II）来评估自噬体形成。

LC3-II的绝对水平：反映特定时间点细胞中自噬体数量的静态指标，是免疫印迹的直接读数之一。

LC3-II/LC3-I比值：一个重要的半定量指标，比值的升高通常提示自噬流的激活和自噬体形成增加。

LC3-II的转化率：通过比较处理组与对照组的LC3-II水平或比值变化，评估干预措施对自噬诱导的效果。

自噬底物p62/SQSTM1的检测：p62是选择性自噬的底物，其蛋白水平的累积通常表明自噬流下游受阻，与LC3-II结果结合分析至关重要。

ATG蛋白家族的检测：可同时检测如ATG5、ATG7、Beclin-1等其他自噬相关蛋白，用于验证自噬通路完整性或机制研究。

溶酶体抑制剂处理下的LC3-II累积：通过使用氯喹或巴弗洛霉素A1阻断自噬体与溶酶体融合，观察LC3-II的累积程度，间接评估自噬流通量。

时间依赖性LC3-II变化：在不同时间点取样检测，描绘LC3-II的动态变化曲线，区分自噬的诱导、持续或抑制阶段。

组织或细胞特异性LC3表达谱：在不同来源的样本JianCe测LC3，分析其基础表达和诱导表达的差异。

磷酸化LC3的检测：研究LC3特定位点的磷酸化修饰，这与其活性和自噬体成熟过程相关。

检测范围

哺乳动物细胞系：适用于HEK293、HeLa、MEF等多种贴壁和悬浮培养的哺乳动物细胞系。

原代细胞：可用于从组织分离培养的原代细胞，如神经元、肝细胞、免疫细胞等。

动物组织样本：适用于小鼠、大鼠等模式动物的肝脏、脑、肌肉、心脏等多种组织匀浆样品。

临床样本：经伦理批准后，可用于部分冻存的人体组织标本或原代肿瘤细胞的研究。

自噬诱导模型：检测营养剥夺（如EBSS处理）、药物（如雷帕霉素）、缺氧、氧化应激等条件下自噬流的变化。

自噬抑制模型：评估使用3-MA（抑制起始）、氯喹/Baf A1（抑制降解）等工具药后的自噬流状态。

基因操作模型：适用于过表达、敲低或敲除特定自噬基因（如ATG5、ATG7）后对自噬流影响的验证。

疾病机制研究：广泛应用于神经退行性疾病、肿瘤、代谢性疾病、感染性疾病中自噬异常的研究。

药物筛选与药效评估：作为体外评价候选药物调节自噬活性的关键分子指标之一。

基础细胞生物学研究：用于研究细胞分化、衰老、程序性死亡等过程中自噬流的角色。

检测方法

细胞总蛋白提取：使用RIPA或NP-40等裂解液，在冰上裂解细胞并收集总蛋白，需添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂。

组织蛋白提取：将新鲜或冻存组织在液氮中研磨，后用裂解液匀浆，离心取上清获得总蛋白。

蛋白浓度测定：采用BCA法或Bradford法对提取的蛋白样品进行精确定量，以确保上样量一致。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：根据LC3-I和LC3-II的分子量差异（约2kDa），使用12%-15%的分离胶进行有效分离。

蛋白质转膜：采用湿转或半干转法将凝胶中的蛋白质转移至PVDF或NC膜上，确保完全转移。

膜封闭：使用5%脱脂牛奶或BSA在室温下封闭1-2小时，以减少非特异性结合。

一抗孵育：使用抗LC3抗体（通常识别LC3A和/或LC3B）以及抗-p62、抗-β-actin/GAPDH抗体，4℃孵育过夜。

二抗孵育：根据一抗来源选择相应的HRP标记二抗，室温孵育1-2小时。

化学发光显影：使用ECL等化学发光底物处理膜，在暗室中通过X光胶片曝光或使用化学发光成像系统采集信号。

图像分析与定量：使用ImageJ等软件对条带灰度值进行定量，计算LC3-II/LC3-I比值及LC3-II与内参的比值。

检测仪器设备

细胞培养箱：提供恒定的温度、湿度和CO2浓度，用于培养待检测的细胞样本。

组织匀浆器：用于将动物或临床组织样本充分研磨和匀浆，以高效提取总蛋白。

低温高速离心机：用于裂解后样品的低温离心，以去除细胞碎片或组织杂质，获取澄清蛋白上清。

微量分光光度计或酶标仪

检测流程

线上咨询或者拨打咨询电话;

获取样品信息和检测项目;

支付检测费用并签署委托书;

开展实验，获取相关数据资料;

出具检测报告。