内参基因稳定性验证

检测项目

候选内参基因筛选：基于文献调研与数据库信息，初步选择多个在待测样本中可能稳定表达的基因作为候选。

样本总RNA提取：从所有实验组与对照组的生物样本中，使用可靠方法提取高纯度、完整性好的总RNA。

RNA浓度与纯度测定：使用分光光度计测定RNA在260nm和280nm处的吸光度，评估其浓度与纯度（A260/A280比值）。

RNA完整性评估：通过琼脂糖凝胶电泳或生物分析仪检测RNA的28S/18S条带比值，确认RNA无降解。

cDNA第一链合成：使用逆转录酶，以等量的总RNA为模板，合成用于qPCR检测的cDNA。

qPCR引物设计与验证：针对每个候选内参基因设计特异性引物，并通过常规PCR和熔解曲线验证其特异性和扩增效率。

实时荧光定量PCR扩增：将各样本cDNA作为模板，对每个候选内参基因进行qPCR扩增，获取循环阈值（Ct值）。

扩增效率计算：通过标准曲线法或专用软件（如LinRegPCR）计算每个候选基因的qPCR扩增效率。

表达稳定性数据分析：利用专业算法（如geNorm、NormFinder、BestKeeper）分析各候选基因在不同样本间的Ct值变异，评估其表达稳定性。

最终内参基因组合确定：根据稳定性排名，选择最稳定的单个基因或多个基因的组合，用于后续目标基因表达的标准化。

检测范围

不同物种样本：适用于人类、小鼠、大鼠、植物、微生物等多种生物体的组织或细胞样本。

不同组织类型：涵盖心脏、肝脏、脑、肾脏、肿瘤组织等多种器官与组织样本。

不同细胞系或原代细胞：包括各种贴壁或悬浮培养的细胞系以及分离的原代细胞。

不同发育阶段样本：适用于胚胎期、幼年期、成年期等不同生长发育阶段的生物样本。

不同处理条件样本：涵盖药物处理、激素刺激、环境胁迫（如缺氧、高温）、基因敲除/过表达等实验干预后的样本。

不同病理状态样本：包括正常组织与疾病组织（如癌与癌旁组织）的对比分析。

不同RNA样本类型：适用于总RNA、mRNA等多种形式的RNA样本。

低丰度表达样本：对于表达量极低的组织或细胞类型，需特别验证内参基因的稳定性。

高通量测序验证样本：可与转录组测序数据结合，从全局表达水平筛选潜在稳定内参基因。

跨平台验证：检测结果应能在不同品牌或型号的qPCR仪上得到稳定复现。

检测方法

TRIzol法提取RNA：使用酚-氯仿有机溶剂法裂解细胞并分离RNA，是一种经典可靠的提取方法。

柱式离心法提取RNA：利用硅胶膜吸附柱特异性结合RNA，操作快速，能有效去除杂质。

琼脂糖凝胶电泳法：通过电泳分离RNA，在紫外灯下观察28S和18S rRNA条带的清晰度与亮度比，评估完整性。

分光光度法：使用紫外-可见分光光度计测量RNA溶液的吸光度，定量并判断蛋白质等污染物残留。

微流控芯片电泳法：使用生物分析仪等设备，通过微流控芯片自动化、高灵敏度地评估RNA完整指数（RIN）。

逆转录PCR法：以Oligo(dT)、随机引物或基因特异性引物引导，在逆转录酶催化下合成cDNA第一链。

SYBR Green I染料法qPCR：使用SYBR Green I荧光染料非特异性结合双链DNA，实时监测PCR产物积累，成本较低，需配合熔解曲线分析确保特异性。

TaqMan探针法qPCR：使用序列特异性的荧光标记探针进行检测，特异性更高，可进行多重PCR。

标准曲线法：将已知浓度的模板进行系列稀释后扩增，绘制Ct值与模板对数浓度的标准曲线，计算扩增效率。

算法分析稳定性法：将获得的Ct值导入geNorm、NormFinder等专用软件，通过计算基因表达变异值（M值）或稳定性值来排序基因稳定性。

检测仪器设备

超净工作台：提供无菌操作环境，防止RNA在提取过程中被RNase污染。

高速低温离心机：用于样本预处理、RNA沉淀、核酸分离等需要低温高速离心的步骤。

微量分光光度计/核酸蛋白测定仪：如NanoDrop，用于微量（1-2μL）核酸样本的浓度与纯度快速检测。

琼脂糖凝胶电泳系统：包括电泳槽、电源和紫外凝胶成像仪，用于可视化评估RNA完整性及PCR产物特异性。

生物分析仪：如Agilent Bioanalyzer，采用微流控芯片技术，自动化、高精度地分析RNA完整性和质量。

PCR仪：用于常规PCR扩增，以验证引物特异性及制备qPCR标准品。

实时荧光定量PCR仪：核心设备，如ABI QuantStudio系列、Bio-Rad CFX系列等，能够实时监测并记录PCR过程中的荧光信号。

超纯水系统：制备无RNase、无DNA酶的超纯水，用于配制所有相关试剂与溶液。

-80℃超低温冰箱：用于长期保存提取的RNA、cDNA等对温度敏感的生物样品。

数据分析计算机与软件：配备专业软件（如仪器配套分析软件、geNorm、NormFinder、GraphPad Prism等），用于处理qPCR原始数据并进行稳定性分析与作图。

检测流程

线上咨询或者拨打咨询电话;

获取样品信息和检测项目;

支付检测费用并签署委托书;

开展实验，获取相关数据资料;

出具检测报告。