时间依赖性抑制试验

检测项目

CYP450酶失活动力学测定：通过测定不同抑制剂浓度和预孵育时间下的酶活性剩余，计算酶失活速率常数（kinact）和半数抑制浓度（KI）。

IC50偏移值测定：比较有/无NADPH预孵育条件下抑制剂IC50值的变化，偏移倍数大于1.5-2倍通常提示存在时间依赖性抑制。

失活半衰期（T1/2）测定：评估在特定抑制剂浓度下，酶活性损失一半所需的时间，是表征抑制强度的重要参数。

KI值测定：表示引起最大半失活速率一半时所需的抑制剂浓度，反映抑制剂与酶的结合亲和力。

kinact值测定：表示最大酶失活速率常数，反映抑制剂使酶失活的内在能力。

抑制可逆性检验：通过超滤、透析或稀释等方法，检验被抑制的酶活性是否能恢复，以确认抑制是否为不可逆或准不可逆。

代谢物介导的抑制评估：鉴别时间依赖性抑制是由原形药物直接引起，还是由其代谢产物介导。

酶特异性筛选：针对CYP1A2、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6、3A4/5等主要亚型进行筛选，确定受影响的特定酶。

抑制类型鉴别：区分机制性抑制（MI）与代谢中间体复合物（MIC）形成等不同类型的时间依赖性抑制。

临床相关性预测（[I]/KI）：结合人体内最大血药浓度（[I]）与KI的比值，初步预测体内发生显著药物相互作用的可能性。

检测范围

创新药物候选物早期筛选：在药物发现阶段，对大量化合物进行快速初筛，剔除具有强TDI风险的候选分子。

药物相互作用（DDI）风险评估：评估新药是否会不可逆地抑制肝药酶，从而影响合用药物的代谢，导致其血药浓度异常升高。

已上市药物的再评价：对临床上出现无法解释的相互作用案例的药物，进行回溯性TDI研究以查明原因。

中药及天然产物活性成分评价：评估复杂提取物或单一天然成分对CYP450酶的潜在时间依赖性抑制作用。

前药活化机制研究：研究某些前药需经代谢活化后才能形成具有TDI活性的中间体。

代谢通路确证：通过TDI试验中特定酶的抑制剂，辅助确认药物代谢的主要酶学通路。

手性药物对映体选择性抑制研究：比较不同对映体在TDI特性上的差异，为手性药物开发提供依据。

毒理学机制研究：探究某些药物引起肝毒性的潜在机制，是否与不可逆抑制代谢酶导致内源性物质蓄积或活性中间体产生有关。

生物技术制品评估：评估治疗性蛋白、抗体等大分子药物对细胞色素P450酶表达的间接长期影响。

监管申报支持：为向FDA、NMPA等监管机构提交新药申请（IND/NDA）提供符合指南要求的体外DDI研究数据。

检测方法

两步孵育法（Two-Step Incubation）：经典方法，第一步将酶、抑制剂与NADPH预孵育；第二步加入探针底物和额外NADPH，测定剩余酶活性。

一步孵育法（One-Step Incubation）：将抑制剂、NADPH、酶和探针底物同时孵育，通过不同时间点取样测定活性变化，操作相对简便。

人肝微粒体（HLM）体外孵育法：最常用的体外系统，使用混合或单个人体肝脏来源的微粒体进行试验。

重组人CYP450酶（rhCYP）孵育法：使用表达单一特定亚型的重组酶系统，用于确证抑制的酶亚型特异性。

肝细胞悬浮液孵育法：使用原代人或动物肝细胞，体系更接近生理环境，可同时评估透膜性和细胞内过程。

液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）定量法：高灵敏度、高特异性地定量分析探针底物的特征代谢产物生成量，计算酶活性。

荧光检测法：使用可产生荧光代谢产物的探针底物，在荧光酶标仪上快速检测，适用于高通量初筛。

发光检测法：利用生物发光或化学发光原理检测酶反应产物，灵敏度高，背景干扰低。

透析/超滤复活实验：预孵育后，通过透析或超滤去除游离抑制剂，再测定酶活性是否恢复，判断抑制可逆性。

稀释复活实验：将预孵育混合物大幅稀释后测定活性，若活性恢复则提示为可逆抑制，反之则提示不可逆抑制。

检测仪器设备

恒温振荡培养箱：提供稳定且均匀的孵育温度（通常37℃）和振荡条件，确保反应均一进行。

多通道移液器：用于快速、准确地完成大量样品的加样、转移和稀释操作，提高实验效率与精度。

高速冷冻离心机：用于终止反应时沉淀蛋白，或制备肝微粒体、肝细胞等实验材料。

液相色谱-串联质谱联用仪（LC-MS/MS）：核心分析设备，用于精准定量代谢产物浓度，是金标准检测手段。

多功能酶标仪：配备荧光、化学发光、紫外-可见光吸收检测模块，用于基于光学原理的高通量筛选。

高效液相色谱仪（HPLC）：配备紫外或荧光检测器，用于分离和定量探针底物及其代谢物。

-80℃超低温冰箱

检测流程

线上咨询或者拨打咨询电话;

获取样品信息和检测项目;

支付检测费用并签署委托书;

开展实验，获取相关数据资料;

出具检测报告。