激酶选择性抑制试验

检测项目

半数抑制浓度测定：测定化合物抑制特定激酶活性50%所需的浓度，是评价抑制效力的核心参数。

激酶谱筛选：在包含数十至数百种激酶的 panel 中测试化合物，初步评估其选择性轮廓。

时间依赖性抑制评估：考察化合物抑制活性是否随时间变化，用于判断其作用机制是否为共价或变构抑制。

ATP竞争性分析：通过改变ATP浓度测定IC50变化，判断抑制剂是否与ATP结合位点竞争。

酶动力学参数测定：包括Km和Vmax值的测定，深入阐明抑制剂对酶促反应动力学的影响。

选择性指数计算：通过比较对靶标激酶与脱靶激酶的IC50值，计算得出定量化的选择性比值。

细胞水平激酶磷酸化抑制：在细胞裂解液或完整细胞中，检测化合物对特定底物磷酸化水平的抑制效果。

结合常数测定：使用生物物理方法如SPR或ITC直接测量抑制剂与激酶的结合亲和力。

脱靶效应验证：对筛选出的潜在脱靶激酶进行独立验证实验，确认其交叉反应性。

数据归一化与统计分析：将原始数据归一化处理，并进行统计学分析，确保结果的可靠性与可比性。

检测范围

蛋白激酶A家族：涵盖PKA及其相关亚型，参与多种细胞信号通路的调节。

蛋白激酶C家族：包括多种对钙离子和脂质敏感的丝氨酸/苏氨酸激酶。

酪氨酸激酶受体家族：如EGFR、VEGFR、PDGFR等，是癌症靶向治疗的重要靶点。

非受体酪氨酸激酶家族：如Src、Abl、JAK等，在细胞内信号转导中起关键作用。

丝裂原活化蛋白激酶家族：包括ERK、JNK、p38等，介导细胞应激、生长和分化信号。

细胞周期依赖性激酶家族：如CDK1、CDK2、CDK4/6等，调控细胞周期进程。

脂激酶家族：如PI3K、mTOR等，主要磷酸化脂质底物，调控细胞生长与代谢。

非典型激酶家族：包括在结构或机制上不同于典型激酶的成员，如Raf、MEK等。

突变型激酶：检测抑制剂对临床常见耐药突变或驱动突变激酶的抑制活性。

种属同源激酶：比较化合物对人源、小鼠源、大鼠源等同源激酶的抑制差异，用于临床前研究参考。

检测方法

放射性同位素法：使用γ-32P ATP作为磷酸供体，通过检测放射性磷酸盐掺入底物来测量活性，是经典的金标准方法。

荧光偏振法：基于荧光标记的磷酸化底物肽在激发下发射偏振光的改变，快速均相检测激酶活性。

时间分辨荧光共振能量转移法：利用镧系元素螯合物与受体荧光团之间的能量转移，灵敏度高，背景低。

发光法：如基于ATP消耗的萤光素酶报告系统，通过检测发光信号间接反映激酶活性。

酶联免疫吸附法：使用磷酸化特异性抗体捕获并检测被磷酸化的底物蛋白或肽段。

均相时间分辨荧光法：结合了FP和TR-FRET的优点，使用特定荧光染料，适用于高通量筛选。

迁移率变动分析：通过电泳迁移率差异分离磷酸化与非磷酸化底物，常用于检测蛋白底物。

表面等离子共振技术：实时、无标记地监测抑制剂分子与固定化激酶之间的结合动力学。

等温滴定量热法：通过精确测量结合过程中释放或吸收的热量，直接测定结合亲和力与热力学参数。

细胞热位移分析：基于化合物结合使靶蛋白热稳定性改变的原理，在细胞裂解液或活细胞中评估靶点结合。

检测仪器设备

多功能酶标仪：具备吸收光、荧光、发光、偏振光等多种检测模式，是进行大部分生化检测的核心设备。

液体处理工作站：用于自动化完成试剂分装、稀释、转移等步骤，提高通量和重复性。

细胞培养箱：为细胞水平的激酶抑制试验提供恒定的温度、湿度和CO2环境。

高速离心机：用于细胞、蛋白样品的快速分离与收集。

蛋白印迹系统：包括电泳、转膜、成像设备，用于验证特定蛋白磷酸化水平的变化。

表面等离子共振仪：专门用于实时、无标记地分析分子间相互作用动力学的高端仪器。

等温滴定量热仪：高灵敏度量热设备，用于精确测定生物分子相互作用的亲和力与热力学。

实时荧光定量PCR仪：可用于检测激酶抑制剂对下游基因表达的影响，间接评估通路抑制效果。

高内涵成像分析系统：结合自动化显微镜与图像分析软件，在细胞水平进行多参数、高通量的表型分析。

数据处理与分析软件：如GraphPad Prism，用于IC50计算、曲线拟合、统计分析和图表制作。

检测流程

线上咨询或者拨打咨询电话;

获取样品信息和检测项目;

支付检测费用并签署委托书;

开展实验，获取相关数据资料;

出具检测报告。