共价抑制剂验证分析

检测项目

共价结合效率评估：测定抑制剂与靶蛋白形成共价键的速率和程度，通常通过反应动力学参数（如kinact/KI）来量化。

靶点占有率分析：定量分析在特定时间和浓度下，被共价抑制剂修饰的靶蛋白占总靶蛋白的比例。

质谱鉴定结合位点：利用质谱技术精确鉴定共价抑制剂在靶蛋白上的具体修饰氨基酸残基（如半胱氨酸、赖氨酸）。

酶活性抑制验证：通过生化实验验证共价抑制剂对靶酶或靶蛋白功能活性的不可逆抑制效果。

选择性谱分析：评估抑制剂对目标靶点与非目标同源蛋白或全蛋白质组的共价修饰选择性。

解离常数（KI）测定：测量抑制剂与靶蛋白初始可逆复合物的解离常数，反映其初始亲和力。

最大失活速率（kinact）测定：表征共价键形成步骤的最大速率常数，反映共价反应的内在效率。

时间依赖性抑制验证：通过预孵育实验，确认抑制效果随抑制剂与酶接触时间的延长而增强，这是共价作用的典型特征。

稀释或透析恢复实验：将抑制剂-靶蛋白复合物进行大量稀释或透析，检测活性是否恢复，以区分可逆与不可逆抑制。

细胞水平靶点修饰验证：在细胞裂解液或活细胞环境中，验证抑制剂对内源性靶蛋白的共价修饰能力。

检测范围

激酶共价抑制剂：针对ATP结合口袋内保守或非保守半胱氨酸的激酶靶向共价药物验证。

蛋白酶体抑制剂：如针对糜蛋白酶样活性的不可逆抑制剂，验证其与催化苏氨酸残基的共价结合。

BTK家族激酶抑制剂：特异性验证对布鲁顿酪氨酸激酶等靶点中C481位点的共价修饰。

KRAS G12C突变体抑制剂：专门验证抑制剂与KRAS癌蛋白G12C突变位点半胱氨酸的共价结合。

EGFR T790M突变体抑制剂：验证第三代EGFR抑制剂对T790M突变位点半胱氨酸的不可逆抑制。

丝氨酸水解酶抑制剂：包括对脂肪酸酰胺水解酶、乙酰胆碱酯酶等活性位点丝氨酸的共价修饰验证。

去泛素化酶抑制剂：验证针对含半胱氨酸活性中心的去泛素化酶的共价抑制。

转录因子抑制剂：如验证与转录因子特定半胱氨酸残基形成共价键的小分子化合物。

片段共价先导化合物：对通过片段筛选得到的弱结合片段进行共价修饰潜力与位点的初步验证。

天然产物来源共价抑制剂：对具有潜在亲电基团的天然产物进行其共价作用机制的系统验证分析。

检测方法

时间进程动力学分析：在不同时间点测定剩余酶活性，用于计算kinact和KI等关键动力学参数。

活性位点滴定法：使用已知浓度的不可逆抑制剂或活性位点探针，确定样品中活性靶蛋白的准确浓度。

LC-MS/MS肽图分析：将酶解后的肽段进行液相色谱-串联质谱分析，直接检测并定位被修饰的特异性肽段。

CETSA（细胞热位移分析）

荧光偏振/共振能量转移检测：利用标记的探针或底物，实时监测共价结合导致的分子结合或构象变化。

ABPP（活性位点蛋白质组学分析）：使用基于探针的化学蛋白质组学技术，在全蛋白质组水平评估抑制剂的选择性。

Western Blotting结合特异性抗体：使用能识别药物-靶点共价复合物的抗体，在细胞或组织样本中进行检测。

检测流程

线上咨询或者拨打咨询电话;

获取样品信息和检测项目;

支付检测费用并签署委托书;

开展实验，获取相关数据资料;

出具检测报告。