NY/T 713-2003 香草兰豆荚中香兰素的测定

NY/T 713-2003 香草兰豆荚中香兰素的测定的部分内容

本标准修改采用ISO5562-2：1999《香英兰测试方法》（英文版）。NY/T713--2003

本标准根据ISO5562-2：1999重新起草。在附录A中列出了本标准章条编号与ISO标准5562-2：1999章条编号的对照一览表。

考虑到我国国情，在采用ISO5562-2：1999时，本标准做了一些修改。有关技术性差异已编入正文中并在它们所涉及的条款的页边空白处用垂直单线标识。在附录B中给出了这些技术性差异及其原因的一览表以供参考。

本标准的附录A、附录B均为资料性附录。本标准由农业部农垦局提出。

本标准起草单位：农业部热带农业产品质量监督检验测试中心。本标准主要起草人：彭黎旭、方佳、吴莉宇、贺利民、冯信平、王明月、刘洪升。1范围

香草兰豆荚中香兰素的测定

NY/T 713-—2003

本标准规定了属于Vanilla fragrans(Salisbury）Ames 和 syn.Vanilla planifolia Andrews种的香草兰中香兰素测定方法。

本标准适用于香草兰豆英、切段和粉末中香兰素的测定。本标准不适用于香草兰豆英抽提物中香兰素的测定。

本标准描述了分析香兰素的三个分析方法：a）高效液相色谱法；

b）紫外分光光度法；

c）气相色谱法。

2规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T12806实验室玻璃仪器单标线容量瓶3高效液相色谱法（仲裁方法）

3.1原理

试样进行抽提和稀释，加内标物，用高效液相色谱法（HPLC)分离，再用紫外检测器测定香兰素的含量。

3.2试剂

分析纯试剂、蒸馏水、去离子水或相等纯度的水。3.2.1乙醇，95%（体积分数）。3.2.2甲醇。

3.2.3磷酸溶液：c(H.PO4)=0.01mol/L。3.2.4流动相：用25份甲醇(3.2.2)与75份稀磷酸（3.2.3)混合。用膜（3.3.3)过滤、脱气。3.2.5香兰素（4-羟基-3-甲氧基苯甲醛）为对照标样，纯度大于99%。3.2.6内标物：乙酰水杨酸，纯度大于99%。3.2.7香兰素储备液：称取一定量的香兰素（3.2.5），精确至0.001g。用流动相配制成为浓度为1g/L的标准储备液。

3.2.8工作溶液

用流动相（3.2.4)稀释储备液（3.2.7），获得工作溶液，使工作溶液的浓度符合3.2.8.1中的要求。香兰素工作溶液浓度为0.1g/L，可在4℃下暗处保存不超过10天。3.2.9内标物溶液

将乙酰水杨酸（3.2.6)溶解于流动相（3.2.4)中，使其浓度为0.6g/L，称量时精确至0.001g。注：内标浓度应与样品溶液中香兰素浓度基本一致。3.3仪器

3.3.1气密研磨器。

NY/T 713-2003

3.3.2单标容量瓶，容量为100mL和200mL，符合GB/T12806的要求。3.3.3过滤膜，孔径为0.45μm。3.3.4连续型索氏抽提仪，由下列部件组成（见图1）。图1连续型索氏抽提仪

-125mL索氏抽提器。

冷凝器。

一250mL磨口烧瓶。

热源：带有滑动变阻器或其他控热方式的电热套或油浴。3.3.5高效液相色谱仪：

紫外检测器；

进样装置；

色谱柱：Cig硅胶柱，5μm～10μm粒径。3.3.6注射器：用于高效液相色谱3.3.7分析天平，精确度为0.001g。3.4试样的制备

将样品(香草兰豆荚、切段或香草兰粉)研磨并使之充分混匀。3.5称样

称20g已制备好的样品，准确至0.001g。3.6抽提

在抽提仪器（3.3.4）中用大约200mL乙醇（3.2.1）抽提试样（3.5）16h，即溶剂进行25次~30次循环。

每一100g豆荚用1L溶剂抽提。

将抽提物转移至一个200mL的容量瓶（3.3.2)中。用少量的乙醇清洗抽提仪器中的烧瓶数次，并将洗出液加人容量瓶中，乙醇定容并混合均匀。用流动相稀释该溶液10倍。

3.7分析步骤

3.7.1色谱操作条件

流动相（3.2.4)流速大约为1mL/min，在3.3.5规定的条件下室温进行分析。3.7.2校准

NY/T 713-—2003

3.7.2.1对照标准品和内标物分别进样，然后两者混合起来进样。调整操作条件使内标和样品峰的分辨率大于 1。

3.7.2.2经过膜（3.3.3)过滤后3.6中制备的样品上机测定。3.7.2.3用10mL内标物与10mL3.2.7所得到的标准溶液混合。用膜过滤上机进样测定峰高或峰面积。

校正因子(k)由式(1)给出。

式中：

k.待测定的组份中组份i的响应系数；上机溶液中组份i中的质量，单位为毫克（mg）；m,

上机溶液中内标物的质量，单位为毫克（mg)；组份i的峰高度，单位为厘米（cm）；h。—内标物的峰高度，单位为厘米(cm）。注：式中峰高可由其蜂面积代替。3.7.3测定

3.7.3.1用10mL内标物与10mL根据3.6制备的样品溶液混合。用膜过滤。3.7.3.2在3.7.2.3规定的条件下将3.7.3.1所得到的溶液进样。待测定的物质的质量用式（2)计算：k; Xh; Xms

式中，各符号的含义与3.7.2.3中的相同。注：式中的峰高可由其峰面积代替。4紫外分光光度法

4.1原理

试样中所含的香兰素用乙醇抽提，用紫外分光光度法测定乙醇溶液中的香兰素含量。4.2试剂

分析纯试剂、蒸馏水、去离子水或者相同纯度的水。4.2.1乙醇，96%（体积分数）。氢氧化钠溶液，c(NaOH)=1 mol/I。4.2.2拿

4.2.3香兰素（4-羟基-3-甲氧基苯甲醛）。4.3仪器

气密研磨器。

100mL、250mL单标容量瓶，符合GB/T12806的要求。4.3.2

10mL、20mL和25mL移液管。

干燥器。

索氏抽提仪（3.3.4）。

分光光度计。

NY/T713-2003

4.3.7样品池，光路长度为1cm。4.3.8称量瓶，容量为25mL，带有气密的塞子。4.3.9分析天平，精确度为0.001g。4.4程序

4.4.1香兰素比吸光度的测定

4.4.1.1标准溶液的制备

在称量瓶（4.3.8)中称取在干燥器（4.3.4)中干燥好的香兰素（4.2.3)约30mg，精确至0.001g。将其溶于约20mL的乙醇（4.2.1)中，转移至一个250mL的容量瓶中。用乙醇冲洗称量瓶数次，并将其倒人容量瓶中，用乙醇定容并摇匀（溶液A1）。用移液管移取25mL溶液A1至100mL的容量瓶（4.3.2)中。用乙醇定容并摇匀（溶液B1）。用移液管移取10ml.溶液B1至100mlL的容量瓶中。加人60mL乙醇和2mL氢氧化钠溶液（4.2.2），混合均匀。用乙醇定容并摇匀（溶液C1）。4.4.1.2参比溶液的制备

将2mL氢氧化钠溶液（4.2.2)用移液管加人一个100mL的容量瓶中，并用乙醇定容并摇勾，制成参比溶液。

4.4.1.3测定

用分光光度计（4.3.6)和样品池（4.3.7)测定并记录在250nm～420nm波长范围的溶液C1相对于参比溶液（4.4.1.2)的光谱图。4.4.1.4计算

最大的吸收发生于350nm±3nm，其吸光度应在0.2～0.8之间。从大约270nm～380nm处画一条基线。

记录最大吸光度（Amax）及相同波长的基线吸光度（Abase），按式（3）计算香兰素的比吸光度（Ei%）：Elg = 100(Amx - Abae)

式中：

m用于制备溶液的香兰素的质量，单位为毫克（mg）。4.4.2试样的制备

将样品磨碎并混合均勾。

4.4.3称样

称取20g已制备好的样品（4.4.2），精确至0.001g。4.4.4抽提

....( 3)

在抽提仪器（4.3.5）中用大约200mL乙醇（4.2.1)抽提试样16h，即溶剂进行25次～30次循环。将其转移至一个250mL的容量瓶（4.3.2)中。用少量的乙醇冲洗抽提仪器中的烧瓶数次，然后将这些洗出液倒人容量瓶（4.3.2)中。用乙醇定容并混合均匀（溶液A2）。4.4.5参比溶液的制备

用移液管将2mL氢氧化钠溶液（4.2.2)加人-一个100mL的容量瓶（4.3.2)用乙醇稀释至刻度，混合均匀，制成参比溶液，

4.4.6测定

用移液管将25mLA2溶液加入一个100mL容量瓶中，用乙醇定容并混合均匀（溶液B2）。用移液管将20mIB2溶液加入一个100mL容量瓶中，用乙醇定容并混合均勾（溶液C2)。用移液管将10mLC2溶液加入一个100ml.容量瓶。加人约60mL乙醇和2mL氢氧化钠溶液（4.2.2）。用乙醇定容并混合均匀(溶液D2)。用分光光度计（4.3.6）和样品池（4.3.7）测定并记录在波长范围250nm～420nmD2溶液相对于4

参比溶液（4.4.5)的光谱图。

4.4.7结果计算

香兰素含量W、用样品质量百分数表示，按式（4)计算：W, = 50 000(Amx -Aba)

Elo ×m

式中：

Amax最大吸光度；

Abase—相同波长下基线处的吸光度；E%——香兰素的比吸光度（4.4.1.4)；m

用于抽提的试样的质量，单位为克（g）。如果要将结果表示为相对于干物质的含量，将产品的水分含量计算进去即可。5气相色谱法

5.1原理

NY/T 713—2003

用无水乙醇抽提试样，加人一种内标物用气相色谱法分离，再用FID检测器测定香兰素的含量。5.2试剂

分析纯。

5.2.1无水乙醇。

5.2.2无水硫酸钠。

5.2.3内标：丁香酚（98%）。

5.2.4香兰素标准品：纯度大于99%。5.2.5标准溶液的配制：准确称取香兰素标准品，用无水乙醇溶解，配制成1.00mg/mL的香兰素标准溶液，分别吸取1.00mL、2.00mL、5.00mL、10.00mL标准溶液于10mL比色管中，用无水乙醇定容到10.00mL，加入2.00μL丁香酚和少量无水硫酸钠，充分摇匀后，上机测定。5.3仪器

5.3.1气相色谱仪，附FID检测器。5.3.2索氏抽提仪（3.3.4)。

5.4样品制备

将样品充分研磨并充分均匀。

5.5分析步骤

5.5.1提取

称取样品约2.5g（5.4），精确至0.001g。用无水乙醇抽提试样16h，即溶剂进行25次～30次循环。提取液合并，定容到100mL，取5.00mL提取液加入2.00uL丁香酚内标，摇匀后上机。5.5.2测定

5.5.2.1气相色谱参考条件

5.5.2.1.1色谱柱：玻璃柱，1.1m×3.2mm，内装填有OV-17ChromsorbW（AW-DMCS），或用同等性能的填充柱或毛细管柱。

5.5.2.1.2温度：柱温180℃，气化室及检测室温度240℃。5.5.2.2色谱分析

吸取1μL试样注人气相色谱仪，记录色谱峰的保留时间和峰高。再吸取1μL混标溶液进样，记录色谱峰的保留时间和峰高。根据组分在色谱上的出峰时间与标准组分比较定性；用内标法与标准比较定量。

NY/T713—-2003

5.6结果计算

5.6.1校正因子(k:)由式(5)给出。式中：

待测定的组份中组份1的响应系数；溶液中组份讠的质量；

溶液中内标物的质量；

色谱图测量到的组份i的峰高；

色谱图测量到的内标物的峰高。注：式中峰高可由其蜂面积代替。待测定的物质的质量按式（6)计算：5.6.2

k: Xh; Xms

式中：各符号的含义与5.6.1中的相同。注：式中峰高可由其蜂面积代替。5.6.3香草兰豆荚中香兰素的质量百分数按式（7)计算：m% =

式中：

m:-溶液中香兰素的质量;

一上机溶液中样品的质量。

（5）

·（6)

附录Ａ

（资料性附录）

本标准章条编号与ISO5562-2章条编号对照表A.1本标准章条编号与ISO 5562-2条编号对照览表本标准章条编号

附录B

（资料性附录）

ISO5562-2章条编号

本标准与ISO5562-2技术性差异及其原因表B.1本标准与ISO5562-2技术性差异及其原因本标准的章条编号

技术性差异

删除了ISO 5562-2中a);b)改为a)、并删除了测定“香兰酸、4-羟基苯甲醛和4-羟基苯甲酸”:c)改为 b);增加了c)气相色谱法测定香草兰豆荚中的香兰素。

ISO 5562-2中“ISO 1042”改为GB/T 12806。

删除了ISO5562-2中3\术语和定义”、4测定香荚兰豆和香荚兰粉的水分含量。本章中的内容与 ISO 5562-2 中的 4. 2一致。对与测定“香兰酸、4-羟基苯甲醛和4-羟基苯甲酸”的相应章节3.2.5、3.2.7、3.2.8的部分进行了删减。

本章中的内容与ISO5562-2中的4.3一致。只是序列号作了相应的变动。ISO5562-2中\ISO1042\改为GB/T12806。本章为新增内容。

NY/T 713—2003

ISO 5562-2 中 a)为测定香英兰豆和香莱兰粉的水分含量，不属于本标准范围。增加的气相色谱法测定香草兰豆荚中的香兰素,已经是成熟和通用的分析方法，所以在本标准中采用。

为了与国内标准的一致。

为了与国内标准的一致。

为了与标准序列号一致。为了与国内标准的一致。

增加气相色谱法测定，使本标准的实施更具有普遍性,标准的可操作性更强。

北检院检验检测中心能够参考《NY/T 713-2003 香草兰豆荚中香兰素的测定》中的检验检测项目，对规范内及相关产品的技术要求及各项指标进行分析测试。并出具检测报告。

检测范围包含《NY/T 713-2003 香草兰豆荚中香兰素的测定》中适用范围中的所有样品。

测试项目

按照标准中给出的实验方法及实验方案、对需要检测的项目进行检验测试，检测项目包含《NY/T 713-2003 香草兰豆荚中香兰素的测定》中规定的所有项目，以及出厂检验、型式检验等。

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检测流程

线上咨询或者拨打咨询电话;

获取样品信息和检测项目;

支付检测费用并签署委托书;

开展实验，获取相关数据资料;

出具检测报告。

北检研究院的服务范围

1、指标检测：按国标、行标及其他规范方法检测

2、仪器共享：按仪器规范或用户提供的规范检测

3、主成分分析：对含量高的组分或你所规定的某种组分进行5~7天检测。

4，样品前处理：对产品进行预处理后，进行样品前处理，包括样品的采集与保存，样品的提取与分离，样品的鉴定以及样品的初步分析，通过逆向剖析确定原料化学名称及含量等共10个步骤;

5、深度分析：根据成分分析对采购的原料标准品做准确的定性定量检测，然后给出参考工艺及原料的推荐。最后对产品的质量控制及生产过程中出现问题及时解决。