GB/T 5009.192-2003 动物性食品中克伦特罗残留量的测定-检测标准-检测项目-北检院

标准中涉及的相关检测项目

在标准《GB/T 5009.192-2003 动物性食品中克伦特罗残留量的测定》中，主要针对以下内容进行了规定：

检测项目：

克伦特罗残留量

该标准给出了具体的检测方法，包括：

高效液相色谱法（HPLC）
酶联免疫吸附试验（ELISA）

标准中涉及的产品主要包括各种动物性食品，如：

猪肉及其制品
牛肉及其制品
禽类及其制品
其他可能含有克伦特罗残留的动物性食品

通过这些检测方法，确保上述动物性食品中克伦特罗的残留量在可控范围内，以维护消费者的健康安全。

GB/T 5009.192-2003 动物性食品中克伦特罗残留量的测定的基本信息

标准名：动物性食品中克伦特罗残留量的测定

标准号：GB/T 5009.192-2003

标准类别：国家标准(GB)

发布日期：2003-08-11

实施日期：2004-01-01

标准状态：现行

GB/T 5009.192-2003 动物性食品中克伦特罗残留量的测定的简介

本标准规定了动物性食品中克伦特罗的测定方法。本标准适用于新鲜或冷冻的畜、禽肉与内脏及其制品中克伦特罗残留的测定。本标准也适用于生物材料(人或动物血液、尿液)中克伦特罗的测定。本方法检出限：第一法气相色谱—质谱法为0.5μg/kg;第二法高效液相色谱法为0.5μg/kg；第三法酶联免疫法为0.5μg/kg。线性范围：第一法气相色谱—质谱法为0.025ng～2.5ng；第二法高效液相色谱法为0.5ng～4ng；第三法酶联免疫法为0．004ng～0.054ng。GB/T5009.192-2003动物性食品中克伦特罗残留量的测定GB/T5009.192-2003

GB/T 5009.192-2003 动物性食品中克伦特罗残留量的测定的部分内容

ICS67.040

中华人民共和国国家标准

GB/T5009.192—2003

动物性食品中克伦特罗残留量的测定Determination of 4-amino-3,5-dichloro-α［(tert-butylamino)methyl]-benzyl alcoho)(clenbuterol) residues in animal foods2003-08-11发布

中华人民共和国卫生部

中国国家标准化管理委员会

2004-01-01实施

GB/T5009.192-2003

本标准修改采用了EUR15127-EN《兽药残留，动物性食品及制品一一参考物质和分析方法，2ndEd,Sg2.1.Cg2.3、Sg2.4和Cy2.3欧盟药残留方法：动物性食品中兽药残留的测定方法》（1994年英文第二版)。

本标准与欧盟《动物性食品中兽药残留的测定方法》Sg2.1、Sg2.3、Sg2.4和Cy2.3不同之处为：Sg2.1.Sg2.3.Sg2.4和Cy2.3为动物性食品中β-兴奋剂的多组分残留检测方法。本标准仅提出动物性食品中克伦特罗单一组分残留的检测方法。Sg2.1为牛尿液中β-兴奋剂的GC-MS筛选方法，Sg2.3为牛尿液中β-兴奋剂的ELISA筛选方法，Sg2.4为牛肝、肾和肉中β-兴奋剂的GC-MS筛选方法，Cy2.3为牛尿液中β-兴奋剂的GC-MS确证方法。本标准则提出从酶联免疫法（ELISA）筛选、高效液相色谱法（HPLC)定量到气质联机法（GC-MS)确证和定证的一套方法，以满足我国动物性食品中克伦特罗残留监控的需要。

本标准中酶联免疫法（ELISA）筛选和气质联机法（GC-MS）的测定原理、操作过程和要求、主要技术参数及检测灵敏度与欧盟方法一致。本标准中的高效液相色谱法（HPLC)是根据实验资料及验证结果提出的。

本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位：中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所、中国肉类食品综合研究中心、北京市疾病预防控制中心。

本标准主要起草人：吴永宁、苗虹、赵云峰、赵京玲、赵榕、吴国华、王凌琰。521

GB/T5009.192-2003

克伦特罗，为强效选择性3：受体激动剂，有强而持久的松弛支气管平滑肌的作用，用于治疗哮喘。克伦特罗可促进动物生长，改善动物体内脂肪分配，并增加瘦肉率。20世纪90年代，我国错误地将其作为科研成果开始以饲料添加剂引人并推广，被俗称为“疫肉精”。一连串因食用含克伦特罗的食物而引起的中森事件发生后，使克伦特罗成了世界上普遍禁用的饲料添加剂。1997年以来，我国有关行政部门多次明令禁止畜牧行业生产、销售和使用盐酸克伦特罗。但我国各地克伦特罗中聋事件仍然频繁发生，说明非法使用克伦特罗现象依然存在。为了对畜食产品中的克伦特罗开展监测，加强市场监督检验力度，预防中毒事件的发生，必须建立有效的检测方法。我国在这方面的检测工作起步较晚，伴随着国际和国内对克伦特罗的禁用和监控要求，迫切需要发展适合我国国情的从筛选到确证的一套检测方法。为此，本标准提出了从酶联免疫法（ELISA)筛选、高效液相色谱法（HPLC)定量到气质联机法（GC-MS）确证和定量这一套方法来满足我国动物性食品中克伦特罗残留监控的需要。

1范围

动物性食品中克伦特罗残留量的测定本标准规定了动物性食品中克伦特罗的测定方法。GB/T5009.192--2003

本标准适用于新鲜或冷冻的畜、禽肉与内脏及其制品中克伦特罗残留的测定。本标准也适用于生物材料(人或动物血液、尿液)中克伦特罗的测定。本方法检出限：第一法气相色谱-质谱法为0.5μg/kg：第二法高效液相色谱法为0.5pg/kg：第三法酶联免疫法为0.5pg/kg。线性范围：第一法气相色谱-质谱法为0.025ng~2.5ng；第二法高效液相色谱法为0.5ng~4ng第三法酶联免疫法为0.004ng~0.054ng第一法气相色谱-质谱法（GC-MS）2原理

固体试样剪碎，用高氣酸溶液匀浆。液体试样加人高氯酸溶液，进行超声加热提取，用异丙醇十乙酸乙酯（40十60）萃取，有机相浓缩，经弱阳离子交换柱进行分离，用乙醇+浓氨水（98+2）溶液洗脱，洗脱液浓缩，经N，O-双三甲基硅烷三氟乙酰胺（BSTFA）衍生后于气质联用仪上进行测定。以美托洛尔为内标，定量。

3试剂

3.1克伦特罗（clenbuterolhydrochloride），纯度≥99.5%。3.2美托洛尔（metoprolol)，纯度≥99%。3.3磷酸二氢钠。

3.4氢氧化钠。

3.5氮化钠。

3.6高氟酸。

浓氨水。

异丙醇。

乙酸乙酯。

甲醇：HPLC级。

甲苯：色谱纯。

乙醇。

衍生剂：N，O-双三甲基硅烷三氟乙酰胺（BSTFA)。高氯酸溶液(0.1mol/L)。

氢氧化钠溶液(1mol/L）。

磷酸二氢钠缓冲液(0.1mol/L,pH=6.0)。异丙醇+乙酸乙酯（40于60）。

乙醇+浓氨水（98+2）。

美托洛尔内标标准溶液：准确称取美托洛尔标准品，用甲醇溶解配成浓度为240mg/L的内标储3.19

备液，贮于冰箱中，使用时用甲醇稀释成2.4mg/L的内标使用液。3.20克伦特罗标准溶液：准确称取克伦特罗标准品，用甲醇溶解配成浓度为250mg/L的标准储备液，贮于冰箱中，使用时用甲醇稀释成0.5mg/L的克伦特罗标准使用液。523

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3.21弱阳离子交换柱（LC-WCX)(3mL）。3.22针筒式微孔过滤膜（0.45μm，水相）。4仪器

4.1气相色谱-质谱联用仪(GC/MS)。4.2磨口玻璃离心管：11.5cm（长）×3.5cm（内径），具塞。4.35mL玻璃离心管。

4.4超声波清洗器。

酸度计。

离心机。

振荡器。

旋转蒸发器。

涡漩式混合器。

恒温加热器。

N2-蒸发器。

2匀浆器。

5分析步骤

5.1提取

5.1.1肌肉、肝脏、肾脏试样

称取肌肉、肝脏或肾脏试样10g（精确到0.01g），用20mL0.1mol/I高氯酸溶液匀浆，置于磨口玻璃离心管中：然后望于超声波清洗器中超声20min，取出置于80℃水浴中加热30min。取出冷却后离心（4500r/min）15min。倾出上清液，沉淀用5mL0.1mol/L高氮酸溶液洗涤，再离心，将两次的上清液合并。用1mol/L氢氧化钠溶液调pH值至9.5士0.1，若有沉淀产生，再离心（4500r/min）10min，将上清液转移至磨口玻璃离心管中，加人8g氯化钠，混勾，加人25ml.异丙醇十乙酸乙酯（40十60），置于振荡器上振荡提取20min。提取完毕，放置5min（若有乳化层稍离心一下）。用吸管小心将上层有机相移至旋转蒸发瓶中，用20mL异丙醇+乙酸乙酯（40+60）再重复萃取一次，合非有机相，于60℃在旋转蒸发器上浓缩至近干。用1mL0.1mol/L磷酸二氢钠级冲液（pH6.0）充分溶解残留物，经针筒式微孔过滤膜过滤，洗涤三次后完全转移至5ml.玻璃离心管中，并用0.1mol/l.磷酸二氢钠缓冲液（pH6.0）定容至刻度。5.1.2尿液试样

用移液管量取尿液5mL，加人20mL0.1mol/1.高氧酸溶液，超声20min混勾。置于80℃水浴中加热30min。以下按5.1.1从“用1mol/L氢氧化钠溶液调pH值至9.5士0.1\起开始操作。5.1.3血液试样

将血液于4500r/min离心，用移液管量取上层血清1mL置于5mL玻璃离心管中，加人2mL0.1mol/L高氯酸溶液，混匀，置于超声波清洗器中超声20min，取比于80℃水浴中加热30min。取出冷却后离心（4500r/min）15min。倾出上清液，沉淀用1ml.0.1mol/l.高氯酸溶液洗涤，离心（4500r/min）10min，合并上清液，再重复一遍洗涤步骤，合并上清液。向上清液中加入约1g氯化钠，加人2mL异丙醇+乙酸乙酯（40十60），在涡漩式混合器上振荡萃取5min，放置5min（若有乳化层稍离心一下），小心移出有机相于5mL玻璃离心管中，按以上萃取步骤重复苯取两次，合并有机相。将有机相在N-浓缩器上吹干。用1mL0.1mol/L磷酸二氢钠缓冲液（pH6.0)充分溶解残留物，经简式微孔过滤膜过滤完全转移至5mL玻璃离心管中，并用0.1mol/l.磷酸二氢钠缓冲液(pH6.0)定容至刻度。5.2净化

依次用10mL乙醇，3mL水、3mL0.1mol/L磷酸二氢钠缓冲液（pH6.0），3ml.水冲洗弱刚离子交换柱，取适量5.1.1、5.1.2和5.1.3的提取液至弱阳离子交换柱上，弃去流出液，分别用4mL水和524

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4mL乙醇冲洗柱子，弃去流出液，用6ml.乙醇十浓氨水（98十2）冲洗柱子，收集流出液。将流出液在N2-蒸发器上浓缩至干。

5.3衍生化

于净化，吹干的试样残渣中加人100μL～500uL甲醇，50μL2.4mg/L的内标工作液，在Nz-蒸发器上浓缩至于，迅速加入40uμL衍生剂（BSTFA)，盖紧塞子，在涡漩式混合器上混匀1min，暨于75℃的恒温加热器中衍生90min。衍生反应完成后取出冷却至室温，在涡漩式混合器上混匀30s，置于N2-蒸发器上浓缩至干。加人200L甲苯，在涡游式混合器上充分混匀，待气质联用仪进样。同时用克伦特罗标准使用液做系列同步衍生。5.4气相色谱-质谱法测定

5.4.1气相色谱-质谱法测定参数设定气相色谱柱：DB-5MS柱，30mX0.25mm×0.25μm。载气：He，柱前压：8psi。

进样口温度：240℃。

进样量：1μL,不分流。

柱温程序：70℃保持1min，以18℃/min速度升至200℃，以5℃/min的速度再升至245℃，再以25℃/min升至280℃并保持2min。EI源

电子变击能：70eV。

离子源温度：200℃。

接口温度：285℃。

溶剂延迟：12min。

EI源检测特征质谱峰：克伦特罗：m/z86、187、243、262；美托洛尔：m/z72、223。5.4.2测定

吸取1ul，衍生的试样液或标准液注人气质联用仪中，以试样峰（m/286，187，243，262，264，277，333）与内标峰（m/z72，223）的相对保留时间定性，要求试样峰中至少有3对选择离子相对强度（与基峰的比例)不超过标准相应选择离子相对强度平均值的土20%或3倍标准差。以试样峰（m/z86)与内标蜂(m/z72)的峰面积比单点或多点校准定量。5.4.3克伦特罗标准与内标衍生后的选择性离子的总离子流图及质谱图见图1~图3。

Clenbute

Cenbuterol

Afetoprolol

m/z72.223

m/z86,187,243,262,264,277,333Metoprolol

图1克伦特罗与内标衍生物的选择性离子总离子流图T

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5.5结果计算

243262364277

TUTTTTTIEI

160180200220240260280300

图2克伦特罗衍生物的选择离子质谱图223

10011012013014015016017018019020021022080

图3内标衍生物的选择离子质谱图按内标法单点或多点校准计算试样中克伦特罗的含量。见式(1)：

式中：

试样中克伦特罗的含量，单位为微克每千克（或微克每升)[ug/kg（或ug/L)；试样色谱峰与内标色谱峰的峰面积比值对应的克伦特罗质量，单位为纳克（ng），f——试样稀释倍数；

m-试样的取样量，单位为克（或毫升）[g或mL)]。计算结果表示到小数点后两位。6精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。第二法高效液相色谱法（HPLC）7原理

（1）

固体试样剪碎，用高氯酸溶液匀浆，液体试样加入高氮酸溶液，进行超声加热提取后，用异丙醇十乙酸乙酯（40+60）萃取，有机相浓缩，经弱阳离子交换柱进行分离，用乙醇+氨（98十2）溶液洗脱，洗脱液经浓缩，流动相定容后在高效液相色谱仪上进行测定，外标法定量。526

8试剂与材料

8.1克伦特罗（clenbuterolhydrochloride），纯度≥99.5%。8.2磷酸二氢钠。

8.3氢氧化钠。

8.4氯化钠。

8.5高氮酸。

浓氨水。

异丙醇。

乙酸乙酯。

甲醇：HPLC级。

艺醇。

高氟酸溶液(0.1mol/L)。

氢氧化钠溶液(1mol/L）。

磷酸二氢钠缓冲液(0.1mol/L，pH=6.0)。异丙醇+乙酸乙酯（40+60）。

乙醇+浓氨水（98+2)。

甲醇+水（45+55）。

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8.17克伦特罗标准溶液的配制：准确称取克伦特罗标准品用甲醇配成浓度为250mg/L的标准储备液，贮于冰箱中：使用时用甲醇稀释成0.5mg/L的克伦特罗标准使用液，进一步用甲醇十水（45+55）适当稀释。

弱阳离子交换柱（LC-WCX)(3mL）。9仪器

水浴超声清洗器。

磨口玻璃离心管：11.5cm（长）×3.5cm（内径），具塞。9.35mL玻璃离心管。

酸度计。

离心机。

振荡器。

旋转蒸发器。

涡漩式混合器。

针简式微孔过滤膜（o.45μm，水相）。9.10

N-蒸发器。

匀浆器。

高效液相色谱仪。

分析步骤

10.1提取

10.1.1肌肉、肝脏、肾脏试样

同5.1.1。

10.1.2尿液试样

同5.1.2。

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10.1.3血液试样

同5.1.3。

10.2净化

同5.2。

10.3试样测定前的准备

于净化、吹于的试样残渣中加人100μL～500μL流动相，在涡漩式混合器上充分振摇，使残渣溶解，液体浑浊时用0.45μm的针简式微孔过滤膜过滤，上清液待进行液相色谱测定。10.4测定

10.4.1液相色谱测定参考条件

色谱柱：BDS或ODS柱，250mmX4.6mm，5m流动相：甲醇+水（45+55）。

流速：1mL/min。

进样量：20μ~50。

柱箱温度：25℃。

紫外检测器：244nm。

10.4.2测定

吸取20μL~50μL标准校正溶液及试样液注人液相色谱仪，以保留时间定性，用外标法单点或多点校准法定量。

10.4.3克伦特罗标准的液相色谱图见图4。

Clenbuterot

图4克伦特罗标准（100μg/L)的高效液相色谱图10.5结果计算

按外标法计算试样中克伦特罗的含量。见式(2)：

式中：

X——试样中克伦特罗的含量，单位为微克每千克（或微克每升）Lg/kg（或μg/L)]；A一一试样色谱峰与标准色谱峰的峰面积比值对应的克伦特罗的质量，单位为纳克（ng)f——试样稀释倍数：

一试样的取样量，单位为克（或毫升)[g（或mL)]。计算结果表示到小数点后两位。11精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。528

12原理

第三法酶联免疫法（ELISA筛选法）GB/T5009.192—2003

禁于抗原抗体反应进行竞争性抑制测定。微孔板包被有针对克伦特罗IgG的包被抗体。克伦特罗抗体被加入，经过孵育及洗涤步骤后，加人竞争性酶标记物、标准或试样溶液。克伦特罗与竞争性酶标记物竞争克伦特罗抗体，没有与抗体连接的克伦特罗标记酶在洗涤步骤中被除去。将底物（过氧化尿素）和发色剂（四甲基联苯胺）加人到孔中孵育，结合的标记酶将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应停止液后使颜色由蓝转变为黄色。在450nm处测量吸光度值，吸光度比值与克伦特罗浓度的自然对数成反比。

13试剂

13.1磷酸二氨钠。

13.2高氯酸。

3异丙醇。

13.4乙酸乙酯。

13.5高氟酸溶液（0.1mol/1.)。氢氧化钠溶液(1mol/L)。

磷酸二氢钠缓冲液（0.1mol/LpH=6.0)。13.7

异丙醇+乙酸乙酯（40+60）。

针简式微孔过滤膜（0.45m，水相）。13.9

克伦特罗酶联免疫试剂盒。

13.10.196孔板（12条×8孔）包被有针对克伦特罗IgG的包被抗抗体。13.10.2克伦待罗系列标准液（至少有5个倍比稀释浓度水平，外加1个空白）。过氧化物酶标记物（浓缩液）。13.10.3

克伦特罗抗体（浓缩液）。

酶底物：过氧化尿素。

发色剂：四甲基联苯胺。

反应停止液：1mol/L硫酸。

缓冲液：酶标记物及抗体浓缩液稀释用。13.10.8

14仪器

超声波清洗器。

磨口玻璃离心管：11.5cm（长）×3.5cm（内径），具塞。14.3

酸度计。

14.4离心机。

14.5振荡器。

14.6旋转蒸发器。

14.7涡漩式混合器。

14.8匀浆器。

14.9酶标仪（配备450nm滤光片）。14.10微量移液器：单道20μL、50μl、100μL和多道50μL~250L可调。529

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15试样测定

15.1提取

15.1.1肌肉、肝脏及肾脏试样

同5.1.1。

15.1.2尿液试样

若尿液浑浊先离心（3000r/min）10min，将上清液适当稀释后上酶标板进行酶联免疫法筛选实验。15.1.3血液试样

将血清或血浆离心（3000r/min）10min，取血l清适当稀释后上酶标板进行酶联免疫法筛选实验。15.2测定

15.2.1试剂的准备

15.2.1.1竞争酶标记物

提供的竞争酶标记物为浓缩液。由于稀释的酶标记物稳定性不好，仅稀释实际需用的酶标记物。在吸取浓缩液之前，要仔细振摇。用缓冲液以1：10的比例稀释酶标记物浓缩液（如400μL浓缩液+4.0mL缓冲液，足够4个微孔板条32孔用）。15.2.1.2克伦特罗抗体

提供的克伦特罗抗体为浓缩液，由于稀释的克伦特罗抗体稳定性变差，仅稀释实际需用量的克伦特罗抗体。在吸取浓缩液之前，要仔细振摇。用缓冲液以1：10的比例稀释抗体浓缩液（如400μL浓缩液+4.0mL缓冲液，足够4个微孔板条32孔用）。15.2.1.3包被有抗抗体的微孔板条将锡箔袋沿横向边压皱外沿剪开，取出需用数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2℃～8℃。15.2.2试样准备

将10.1的提取物取20μL进行分析。高残留的试样用蒸馏水进-步稀释。15.2.3测定

使用前将试剂盒在室温（19℃～25℃）下放置1h2h。15.2.3.1

将标准和试样（至少按双平行实验计算）所用数量的孔条插人微孔架，记录标准和试样的位置。

15.2.3.2加入100μl.稀释后的抗体溶液到每一个微孔中。充分混合并在室温孵育15min。15.2.3.3倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打（每行拍打3次）以保证完全除去孔中的液体。用250μL蒸馏水充人孔中，再次倒掉微孔中液体，再重复操作两遍以上。15.2.3.4加人20μ1.的标准或处理好的试样到各自的微孔中。标准和试样至少做两个平行实验。15.2.3.5加入100μL稀释的酶标记物，室温孵育30min。15.2.3.6倒出孔中的液体，将微孔架例置在吸水纸上拍打（每行拍打3次）以保证完全除去孔中的液体。用250uL蒸馅水充人孔中，再次倒掉微孔中液体，再重复操作两次以上。15.2.3.7加人50μL酶底物和50μL.发色试剂到微孔中，充分混合并在室温暗处孵育15min。15.2.3.8加人100μL反应停止液到微孔中。混合好尽快在450nm波长处测量吸光度值。15.3结果计算

用所获得的标准溶液和试样溶液吸光度值与空白溶液的比值进行计算。见式（3）：相对吸光度值（%）=B/B。×100式中：

B——标准(或试样)溶液的吸光度值；Bo——空白(浓度为0的标准溶液）的吸光度值。530

（3）

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将计算的相对吸光度值（%）对应克伦特罗浓度（ng/L）的自然对数作半对数坐标系统曲线图，校正曲线在0.004ng~0.054ng（200ng/L～2000ng/L范围内）呈线性，对应的试样浓度可从校正曲线算出。

见式（4)：

式中：

mx1000

一试样中克伦特罗的含量，单位为微克每千克（或微克每升）[μg/kg（或μg/1）lA一试样的相对吸光度值（%）对应的克伦特罗含量，单位为纳克每升（ng/L）；f—试样稀释倍数：

m-试样的取样量，单位为克（或毫升）g（或mL)]。计算结果表示到小数点后两位。阳性结果需要经过第一法确证。精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。（4）

现行